Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

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1 Tecnolo gie per la Medicina Rigenerativa Tema d’esame del 21.01.2022 : Soluzioni 1) Descrivere che cos'è la buona pratica di laboratorio (good laboratory practice, GLP) ed elencare e discutere ciascuna delle regole minime , richieste per lo sviluppo di PTC e i test in vitro. ( Punti 4/33) La Good Laboratory Practice incarna una serie di principi che forniscono un quadro all'interno del quale gli studi di laboratorio sono pianificati, eseguiti, monitorati, registrati, riportat i e archiviati. La GLP aiuta a garantire all'autorità di regolamentazione sanitaria che i dati presentati rispecchiano fedelmente i risultati ottenuti durante lo studio e possono quindi essere considerati affidabili quando si effettuano valutazione del ris chio. Secondo gli standard GLP, ci sono tre requisiti minimi per lo sviluppo di PTC e i test in vitro. 1) Selezione del metodo di coltura più adatto: come , ad esempio , il passaggio da coltura statica a sistemi dinamici (bioreattori) o la selezione del biorea ttore appropriato (bioreattori convenzionali o monouso, coltura attaccata o in sospensione, scale -up lineare o modulare ...). 2) Selezione del processo di coltura più adatto: come, ad esempio, metodi di monitoraggio dei parametri di coltura cellulare (vitalità cellulare, densità cellulare, pH, produzione e consumo di metaboliti, inclusi glucosio, lattato, ossigeno) e confronto di diversi processi di coltura con diversi bioreattori (in termini d ei parametri di coltura misurati). 3) Sviluppo di test analitici specifici per il controllo qualità e sicurezza: come alcuni test per il monitoraggio di sterilità e contaminazione incrociata, della presenza di contaminanti o della concentrazione proteica . 2) Descrivere le fasi della risposta alla lesione da compressione del midollo spinale. ( Punti 4/33). 1. Schiacciamento e necrosi cellulare L’evento traumatico iniziale (ovvero, la lesione primaria) produce un’immediata rottura meccanica e la dislocazione della colonna vertebrale, che causa una compressione del midollo spinale, con conseguente danno cellulare. 2. Fase acuta Emorragia e rottura dell’apporto di sangue nell’area. 3. Fase secondaria iniziale Rilascio delle citochine infiammatorie, stress ossidativo e accumulo di fluido nel sito della lesione. In aggiunta, vi è proliferazione degli astrociti e deposito di molecole della matrice extracellulare nella regione perilesionale. 4. Fase secondaria tardiva Cavitazione centrale e apoptosi di n euroni e oligodendrociti, con perdita dello strato mielinico con conseguente danno permanente della funzionalità negli assoni superstiti. In aggiunta, vi è formazione di una cicatrice della glia che, insieme alla cavitazione, inibisce la rigenerazione. 2 3) Un monostrato di cellule aderenti, sensibili agli sforzi tangenziali, è coltivato sul fondo di una camera a flusso di forma parallelepipeda (larghezza x altezza x lunghezza: w x h x l), come illustrato in figura. Da progetto, il medium scorre nella camera ad una portata Q. Con il progetto attuale, il flusso è laminare e lo sforzo di taglio, W , che agisce sulle cellule è troppo elevato; per portarlo al di sotto di una soglia ragionevole, deve essere ridotto di un fattore 4. Elencare le possibili modifiche alle dimensioni della camera (una modifica alla volta) che portano alla riduzione dello sforzo di taglio di un fattore 4. Per ogni modifica, valutare se esiste il rischio che il moto diventi turbolento. Si assuma di poter applic are la formulazion e semplificata usata per l e camer e di perfusione planar i. Si assuma il diametro idraulico pari all ’altezza h. ( Punti 5/33) Lo sforzo di taglio in una camera di perfusione planare è (Handouts, p. 119): Tau = 6*Q*mu/(w*h^2) Il numero di Reynolds (Handouts, p. 116), espresso in funzione del diame tro idraulico h, corrisponde a : Re = rho*v*h/mu Dove la velocità media del fluido, v, può essere scritta come: v = Q/(w*h) Dunqu e, Re = rho*Q/(mu*w) Modifica #1 : aumenta re la larghezza w di un fattore 4 : w'=4w --> Ta u'=1/4*Tau Re'=1/4*Re --> nessun rischio di turbolenza Mo difica #2 : aumenta l'altezza della camera h di un fattore 2 : h'=2h --> Tau'=1/4*Tau Re'=Re -->nessun rischio di turbolenza PANCREAS BIOARTIFICIAL E EXTRAVASC OLAR E Consideriamo un pancreas bioartificiale extra vascolare , formato da microcapsule sferiche cave costituite da una membrana polimerica semipermeabile , con una dimensione media dei pori di 10 nm e uno spessore d i tale membrana trascurabile. La capsula (Fig. 1) è riempita di cellule  pancreatiche e impiantate nello spazio intraperitoneale di topi diabetici, che si presume siano altamente vascolarizzati , in modo tale che i nutrienti e l’ossigeno vengano trasportati all’interno delle isole e invece l'insulina venga trasportata al loro esterno, n ello spazio peritoneale. Q 3 Fig. 1:Schem a di una capsula vista in sezione . 4) Rispondere brevemente alle domande in tabella . (Punti 3/33) Qual è il prodotto terapeutico? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? Il PTC consiste in capsul e semipermeabil i contenente le cellule  Il principale agente terapeutico sono le cellule pancreatiche, ottenute dopo "manipolazione non minima" consistente nell'isolamento e incapsulamento dopo una eventuale espan sione cellulare . In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTC si può collocare questo particolare PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questa determinata fase del processo di sviluppo del PTC? Trial p re-clinical (su animal e) Good Manufacturing Practice (GMP) per la produzione del PTC ; Good Clinical Practice (GCP) per i suoi test pre -clinici. Quali sono i rischi associate con questo PTC (immunogenicità, tumorigenicità, formazione di teratomi, infezione, tossicità)? Rigetto immunologico : NO, a meno che la capsula si rompa provocando la fuoriuscita delle cellule. Il rischio di immunogenicità esiste solo a causa d i citochine (di dimensione inferior e a 10 nm ) Formazione di tumore: NO , perché ’ le cellule non sono multipotenti e, inoltre, sono isolate dal paziente ; eve ntualmente possibile a causa del materiale polimerico della membrana delle capsule o a causa della sua degradazione Formazione di Teratoma : NO , perché ’ le cellule non sono pluripo tenti e, inoltre, sono isolate dal paziente Trasmissione di infezioni: SI. a causa del materiale donato o di qualsiasi manipolazione e per la possibile presenza di patogeni più piccoli di 10 nm Tossicità: SI. a causa del materiale donato o di qualsiasi manipolazione e per la possibile presenza di molecole tossiche più piccol e di 10 nm 4 5) Compila la tabella sottostante elencando e discutendo i tipi di cellule che possono essere potenzialmente utilizzati in c linica per questa terapia rigenerativa . (Punti 5/33) Sorgente cellulare (basata su immunogenici tà) Tipo cellulare Vantaggi Criticità Autologa Cellule  isolate dal paziente stesso (ed espanse ) Compatibilità immunologica Non esistono cellule  funzionali nel tessuto pancreatico del paziente Autologa iPS ottenute da cellule somatiche del paziente e differenziate in cellule  Compatibilità immunologica Limiti tecnici nei protocolli di re-differenziamento Rischio di teratoma ° Singenica ESC isolate da un clone del paziente e differenziate in cellule  Compatibilità immunologica a parte il DNA mitocondriale Limiti etici e regolatori per cellule derivate da clone (vietate in Italia) Limitazioni nei protocolli di differenziamento Rischio di teratoma ° Allogenica Cellule  isolate da un donatore umano (ed espanse ) Puo’ essere industrializzabile Disponibile da donatori HLA compatibili Disponibilità limitata Rischio di reazione immunitaria #° Xenogenica Cellule  isolate da un donatore non umano (ed espanse ) Disponibili da allevamenti animali La terapia può essere industrializzata Rigetto immunologico acuto #° Limitata funzionalità biologica Trasmissione di xeno -zoonosi # Nota: °Il rischio di teratoma e di rigetto immunitario è presente nel raro caso di guasto meccanico del dispositivo. # rischio presente solo per patogeni o molecole di dimensioni inferiori a 10 nm (o per eventuale cedimento meccanico della membrana ). 5 6) Assumendo condizioni di assenza di convezione e di stato stazionario, calcolare il profilo della concentrazione c(r) di insulina all'interno della capsula, in funzione della coordinata radiale r. Il coefficiente di diffusione dell'insulina è D (noto e costante), il tasso di produzione di insulina è P (noto e costante) e la concentrazione di insulina nello spazio intraperitoneale è c* (nota e costante). Assumere una simmetria sferica per il profilo di concentrazione nella capsula. Trascurare il consumo c ellulare di insulina. Utilizzare il sistema di coordinate indicato nello schema sopra. 6.1) Scrivere l'equazione generale del trasporto di massa nel volume di controllo. Eliminare i termini che possono essere considerati nulli o trascurabili e giustificare ogni eliminazione. Scrivi l'equazione semplificata finale da risolvere . (Punti 3/33) Volume di controllo 0