logo
  • userLoginStatus

Welcome

Our website is made possible by displaying online advertisements to our visitors.
Please disable your ad blocker to continue.

Current View

Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

Liver

Divided by topic

1 FEGATO BIOARTIFICIALE – Un’alternativa al trapianto Introduzione Il fegato sano è strategicamente posizionato nel corpo come una sorta di barriera tra la circolazione splancnica e quella sistemica, con un ruolo importante nella regolazione dell'omeostasi dell’organismo. È responsabile della sintesi proteica, del metabolismo dei carboidrati e dei lipidi, della produzione di bile, del metabolismo del colesterolo, dell'equilibrio acido-base, della disintossicazione dai composti legati alle proteine e dai lipidi solubili, e dello stoccaggio di composti essenziali come vitamine, minerali e glicogeno. Inoltre, lo specifico sistema epatico dei macrofagi (cellule di Kupffer) svolge un ruolo importante nella rimozione delle endotossine e nella protezione immunitaria. La forma patologica più improvvisa è l'insufficienza epatica acuta (acute liver failure, ALF). Attualmente, l'unica modalità di trattamento per i pazienti con grave insufficienza epatica è il trapianto di fegato ortotopico (orthotopic liver transplantation, OLT). La crescente incidenza di malattie del fegato, insieme alla persistente carenza di organi da donatori, ha stimolato lo sviluppo di molte terapie per l'insufficienza epatica alternative al trapianto. C’è un enorme interesse nello sviluppo di tecniche per fornire supporto epatico temporaneo per sostenere il paziente con insufficienza epatica in attesa di trapianto o di rigenerazione epatica. Queste tecniche possono essere sommariamente suddivise in tecniche di supporto epatico biologico e tecniche di supporto non cellulare. Il fegato bioartificiale extracorporeo (bioartificial liver, BAL), è una tecnica studiata da oltre 40 anni, tuttora in fase di sviluppo, con l’obbiettivo di accelerare il recupero dall'insufficienza epatica acuta o fornire una soluzione ponte per il trapianto. I dispositivi BAL, tipicamente, prevedono l’utilizzo di epatociti isolati messi in coltura all’interno di un bioreattore a membrana, che viene perfuso dal plasma del paziente. Il progetto dei bioreattore mira a mantenere la vitalità e la funzione cellulare senza ostacolare lo scambio di nutrienti e metaboliti, così da ottenere una buona efficacia terapeutica. SUPPORTO EPATICO NON CELLULARE: si tratta di trattamenti basati sul principio della disintossicazione del plasma del paziente dalle tossine idrosolubili o legate alle proteine che causano encefalopatia epatica (HE) o insufficienza multiorgano (MOF). Essi sono: (i) dialisi; (ii) filtrazione (convezione di grandi molecole attraverso una membrana); (iii) adsorbimento con carboni attivi, resine o albumina; (iv) diluizione (scambio di volumi di plasma); (v) una combinazione dei metodi precedenti (dia-filtrazione, dia-adsorbimento). Queste terapie hanno mostrato un certo beneficio per il supporto epatico a breve termine nei pazienti con ALF moderata. SUPPORTO EPATICO BIOLOGICO: La tecnologia delle fibre cave viene spesso utilizzata per separare il compartimento cellulare da quello perfuso dal plasma, e per fornire un'impalcatura di base (scaffold) per l'adesione degli epatociti. Sono stati affrontati con successo i problemi specifici di reazione immunitaria, xenozoonosi e cancerogenicità, fino ad ottenere l'approvazione normativa di alcuni sistemi per l'introduzione nella clinica. Tuttavia, diversi sistemi non hanno ancora fornito prove inequivocabili di efficacia. 2 Fonti cellulari Gli epatociti primari suini sono la componente cellulare più comunemente usata negli attuali dispositivi BAL. È stato stimato che, teoricamente, è necessario circa il 20% di un fegato sano, che corrisponde a 200g, o 20 × 10 9 epatociti ben funzionanti, per mantenere in vita un paziente con ALF, nell’ipotesi che il paziente non possieda massa epatica attiva residua. Le cellule suine necessarie per fornire un trattamento adeguato sono qualcosa di prontamente disponibile. Tuttavia, non sono ancora stati completamente compresi i segnali con cui è necessario stimolarle per mantenere attive in vitro le loro funzioni epato-specifiche. Idealmente, nei sistemi BAL potrebbero essere utilizzati epatociti umani primari; tuttavia l'elevata domanda di organi da donatore rende del tutto improbabile la disponibilità di tessuto in eccesso, che sia sufficiente per applicazioni diverse dal trapianto. Inoltre, mentre gli epatociti maturi proliferano rapidamente in vivo durante la naturale rigenerazione epatica, gli epatociti primari umani, quando usati in vitro, pur in condizioni di coltura ottimali, tendono ad espandere molto meno facilmente. Se la ricerca rivelasse gli stimoli corretti per ottenere una proliferazione prolungata degli epatociti umani in vitro, il settore dei dispositivi BAL sarebbe rivoluzionato. Nel frattempo, si è affrontato lo sviluppo di epatociti allogenici altamente funzionali, che possono essere espansi in vitro, creando linee cellulari derivate da tumori, linee cellulari immortalizzate e inoltre cercando di direzionare cellule staminali verso una progenie di tipo epatico. Diverse linee cellulari di epatociti sono state derivate da tumori epatici umani. La principale preoccupazione per la sicurezza nell'utilizzo di linee cellulari derivate da tumori è la trasmissione di cellule tumorigeniche al paziente, il che motiva l'integrazione di filtri cellulari nei sistemi BAL come precauzione aggiuntiva. Questi problemi immunologici possono essere comunque evitati limitando a cinque-sei giorni l’uso dei trattamenti BAL basati sull’uso di cellule suine. [4] [5] [6] Riferimenti bibliografici: [1] http://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CRL-10741.aspx - generalinformation [2] S. Mantero, A. Remuzzi, M.T. Raimondi, A. Alhluwalia, Fondamenti di Ingegneria dei Tessuti per la Medicina Rigenerativa, Editore: Patron Ed, Padova, Anno edizione: 2009, ISBN: 978-88-555-3039-2 [3] Brotherton, J. D. and Chau, P. C. (1996), Modeling of Axial-Flow Hollow Fiber Cell Culture Bioreactors. Biotechnol Progress, 12: 575–590. doi: 10.1021/bp960002g [4] Chamuleau, R. A., Poyck, P. P. and Van De Kerkhove, M.-P. (2006), Bioartificial Liver: Its Pros and Cons. Therapeutic Apheresis and Dialysis, 10: 168–174. doi: 10.1111/j.1744-9987.2006.00359.x [5] Patzer, J. F., Mazariegos, G. V., Lopez, R., Molmenti, E., Gerber, D., Riddervold, F., Khanna, A., Yin, W.-Y., Chen, Y., Scott, V. L., Aggarwal, S., Kramer, D. J., Wagner, R. A., Zhu, Y., Fulmer, M. L., Block, G. D. And Amiot, B. P. (1999), Novel Bioartificial Liver Support System: Preclinical Evaluation. Annals of the New York Academy of Sciences, 875: 340–352. doi: 10.1111/j.1749-6632.1999.tb08516.x [6] Allen, J. W., & Bhatia, S. N. (2002, December). Improving the next generation of bioartificial liver devices. In Seminars in cell & developmental biology (Vol. 13, No. 6, pp. 447-454). Academic Press. [7] Werner, A., Duvar, S., Müthing, J., Büntemeyer, H., Lünsdorf, H., Strauss, M. and Lehmann, J. (2000), Cultivation of immortalized human hepatocytes HepZ on macroporous CultiSpher G microcarriers. Biotechnol. Bioeng., 68: 59–70. doi: 10.1002/(SICI)1097-0290(20000405)68:13.0.CO;2-N 3 ESERCIZI: 1) Determinare il tempo necessario per ottenere una quantità di 10 10 epatociti (il numero approssimativo di epatociti di un fegato sano), per equipaggiare un sistema di fegato bioartificiale (BAL) utilizzando cellule immortalizzate della linea C3A [HepG2/C3A, derivata of Hep G2 (ATCC HB-8065)] e quantificare il costo per la materia prima ( cioè le cellule). Caso 1 ) La quantità finale di 10 10 epatociti è ottenuta da una singola fiala iniziale. Caso 2 ) Si consideri di utilizzare una fiala per ciascuna cartuccia del BAL (n = 10 cartucce), ciascuna cartuccia contenente 10 9 epatociti, e si confrontino con il Caso 1 il tempo necessario e il costo per le materie prime . Il tempo di duplicazione per la linea cellulare C3A in coltura 2D è di circa 40 h. Ogni fiala contiene 3 milioni di epatociti e il suo costo è di 534 $. DATI Caso 1 ) Xf1=10 10 epatociti td_2d =40h 1 fiala  X i=3*10 6 cellule, costo: 534$ Caso 2 ) n=10 cartucce Xf2=n*10 9 epatociti= 10 10 epatociti 10 fiale  X i=10* 3*10 6 cellule = 3*10 7 cellule [SOLUZIONE] Caso 1) Una fiala di cellule C3A ������������=������������ ������������∙������������ ������������������������=40 ℎ ������������=ln (������������ ������������ ������������������������) ln2 =? ������������������������=������������ ������������∙2 ������������ ---> ������������= ln( ������������ ������������ ������������������������ ) ln2 = ln( 1010 3∙106 ) 0.69= ln(3333) 0.69 = 0.1 0.69 =11.75 ---> ������������ ≅12 ������������=������������ ������������∙������������=40 ℎ∙12=480 ℎ∙ ������������ 24 ℎ =20 d (1 fiala  costo =534$) NB: In un contesto clinico reale, una attesa di 20 giorni non sarebbe accettabile. 4 Caso 2 ) 10 fiale di cellule C3A 10 fiale  X i=10 ⋅3 ⋅10 6 cell ule = 3 ⋅10 7 cell ule ������������= ln( ������������ ������������ ������������������������ ) ln2 = ln( 1010 3∙107 ) 0.69= ln(333) 0.69 = 5.8 0.69 =8,4 ---> ������������≅9 ������������=������������ ������������∙������������=40 ℎ∙9=15 d Costo totale = 5340$ NB: Non abbiamo alcun reale vantaggio dal punto di vista della durata: 15 giorni sono ancora molti per un'applicazione clinica. 5 2 ) Calcolare la portata del fluido necessaria per ciascuna cartuccia, utilizzando epatociti primari o, in alternativa, epatociti derivati da una linea cellulare immortalizzata. Si considerino 10 cartucce in parallelo, con 10 9 cellule per ciascuna. Il consumo di ossigeno degli epatociti è: ������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ������������ ∙ℎ Coefficiente di solubilità: α=1.3×10 −3µ mol ������������������������������������������������ Impostare la differenza di concentrazione di ossigeno (ingresso-uscita) nel mezzo di coltura assumendo che le pressioni parziali siano 20%∙������������ DATI ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ������������ ∙ℎ α =1.3×10 −3 µmol ������������������������×������������������������������������������������ Pin = 20%∙������������ Xf= 10 cartucce *10 9 cellule=10 10 cellule [SOLUZIONE] Modello compartimentale: ������������������������ ������������������������ ������������������������������������ =������������ 1������������1−������������ 2������������2+������������−������������ Dove: ������������������������ ������������������������ =0 (condizioni stazionarie, accumulo nullo) ������������ 1=������������ 2=������������ p = produzione di ossigeno = 0 (produzione assente) v = consumo di ossigeno costante ������������∙∆������������=������������ 10 cartridges in parallel Co nsumo cellulare: ������������������������������������������������������������ = ������������/������������������������ Consumo complessivo: ������������=������������ ������������= ������������ ∗������������ Q CIN Q COUT 6 ������������ =������������ ℎ ������������= ������������ ℎ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ∙������������ ������������ ( ������������ ������������������������ −������������ ������������������������������������ ) ������������ ������������ =0.2∗760∗1.3∗10 −3µ mol ������������������������ =197.6 nmol ������������������������ ������������ =0.01∗760∗1.3∗10 −3 µmol ������������������������ =9.88 ������������������������������������������������ ������������������������ Δ������������=������������ ������������������������ −������������ ������������������������������������ =187.7 ������������ ������������������������������������ ������������������������ Usando epatociti di una linea cellulare immortalizzata: ������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������= 1950 ������������ ������������ ������������ 24ℎ = 81.25 ������������ ∙ℎ ������������ 10 ������������������������������������������������������������������������������������������������ = ������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ℎ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ∙������������ ������������ ( ������������ ������������������������ −������������ ������������������������������������ ) = 81.25 ������������ ������������������������������������ 10 6������������������������������������������������������������������������������������∙ℎ ∙10 10 ������������������������������������������������������������������������������������ 187.7������������ ������������������������������������ ������������������������ =4328������������������������ ℎ ℎ 60������������������������������������ =72������������������������ ������������������������������������ ������������ 1 ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ =������������.������������ ������������������������ ������������������������������������ =7.2 ������������������������ ������������������������������������ 103������������������������ 3 ������������������������ ������������������������������������60������������ = 120 ������������������������ ������������ 3 Usando epatociti primari: ������������ ∙ℎ ������������ 10 ������������������������������������������������������������������������������������������������ = ������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������ ℎ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ∙������������ ������������ ( ������������ ������������������������ −������������ ������������������������������������ ) = 10 3 ������������ ������������������������������������ 10 6������������������������������������������������������������������������������������∙ℎ ∙10 10 ������������������������������������������������������������������������������������ 187.720������������ ������������������������������������ ������������������������ =53270������������������������ ℎ =887,8������������������������ ������������������������������������ ������������ 1 ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ = ������������ 10 ������������������������������������������������������������������������������������������������ 10 =������������������������.������������ ������������������������ ������������������������������������ =88.8 *1000/60= 1479.8 ������������������������ ������������ 3 NOTE: Considerazioni nella prospettiva di un uso clinico del BAL. Una portata totale di quasi 900 ml/min è piuttosto elevata per un trattamento extracorporeo del sangue. Per confronto, si considerino i trattamenti di emodialisi, in cui la portata di sangue è dell'ordine di 200-300 ml/min. In questa condizione sarà strettamente necessario il disaccoppiamento del circuito BAL rispetto a quello del paziente. L'uso di cellule immortalizzate comporta una portata molto più ragionevole (72 ml/min) rispetto all'uso di epatociti primari. 7 3 ) Si consideri il bioreattore schematizzato nelle Figure 1 e 2, contenente epatociti derivati da una linea cellulare immortalizzata. Sulla base dei dati forniti di seguito, determinare il numero di fibre che formano ciascuna cartuccia. Calculare il numero di Péclet e il numero di Reynolds. DATI Velocità assiale del medium v�=0.0303 ������������������������ ������������ Raggio interno della fibra ������������=3 ������������������������ Spessore dell’aggregato di cellule che circonda ogni fibra ������������=0.2 ������������������������ Lunghezza della fibra ������������=180 ������������������������ Coefficiente di diffusione ������������ ������������2=2∙10 −5 ������������ =2∙10 −3 ������������ Portata ������������ 1 ������������ ������������������������ ������������������������������������ Densità ������������=999.87∙10 −9������������ 3 V iscosità ������������=6.91∙10 −7������������ ������������ ������������������������������������������������������������������������ =������������ ������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ v�∙������������ ������������������������ =������������ ∙v� ������������ ������������2 ������������ ������������ ������������ [SOLUZIONE] ������������ 1 ������������ ������������������������ ������������������������������������ = ������������. ������������ ������������������������ ������������������������������������ ������������������������������������ 60������������= 0.12 ������������������������ ������������������������������������ =0.12 ������������������������ ������������������������������������ 1000 ������������������������ =120 ������������ ������������ ������������������������������������������������������������ 1 ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ =������������ 1 ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ v�∙������������ =������������ 1 ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ v�∙(������������∗������������ 2)=120 ������������������������ 3 ������������ 0 .0303������������������������ ������������ ∙(������������∙3 2 ������������������������ 2) =������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ Considerando un aggregato di cellule isotropo: Il numero di Peclet è ������������ 2= 3 ������������������������������������ 2∙10 −3������������������������ 2 ������������ = ������������ ������������ ������������ = v �∙2������������∙ ������������ ������������ =0 .0303 ������������������������ ������������ ∙6 ������������������������∙999.87∙10 −9 ������������ 3 6.91∙10 −7 ������������ ������������ ~ 8 4 ) Utilizzando i dati seguenti, calcolare la pressione parziale dell'ossigeno nel punto meno ossigenato di ciascuna cartuccia. Trascurare lo spessore delle fibre. DATI P in= 20%∙������������ Xf =10 9 cell α =1.3×10 −3 µmol ������������������������×������������������������������������������������ Raggio della cartuccia ������������������������ ������������ Raggio interno della fibra ������������=3 ������������������������ Spessore aggregato cellulare ������������=0.2 ������������������������ Lunghezza della fibra ������������=180 ������������������������ ������������ ������������2=2∙10 −5 ������������ ������������ =2∙10 −3 ������������������������ 2 ������������ Numero di fibre =140 ������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ∙ℎ [SOLUZIONE] Formulazione di Krogh-Blum: ������������ �������������1 2( ������������ �������������− ������������v ��� ������������′ ������������� 2 −1������������� dove: C out , la concentrazione all'estremità distale, è funzione della posizione radiale: C out =C out (r) C in è la concentrazione nel mezzo che entra all'estremità prossimale della cartuccia: ������������ ������������ ������������������������ =197.6 nmol ������������������������ =0.198 ������������ 3 Lunghezza del cilindro L=180 mm Raggio esterno: R’= ������������+������������=0.2������������������������+3������������������������=3.2 ������������������������ Raggio interno ������������=3 ������������������������ Velocità del medium nel capillare v�=0.0303 ������������������������ ������������ Coefficiente di diffusione ������������=������������ ������������2=2∙10 −5 ������������ =2∙10 −3 ������������ Consumo volumetrico [µmol/(ml*h)] ������������=������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������ ������������������������������������ = ������������������������ π )= 109 π180( 1436.9−140∗ )= 109 3 = 104 3 [=10 7cellule ml ] 9 ������������=������������ ℎ������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ∙������������ ������������=81.25 ������������ ������������������������������������ 10 6������������������������������������������������������������������������������������∙ℎ ∙10 4������������������������������������������������������������ ������������������������ ������������������������ 3 =0.81������������ ������������������������������������ ������������������������ 3∙ℎ =0.81������������ ������������������������������������ ������������������������ 3∙ℎ ∙ℎ 60������������������������������������ ∙������������������������������������ 60������������ =∙=0.00025������������ ������������������������������������ ������������������������ 3∙������������ Calcoliamo C out in corrispondenza del raggio esterno all'estremità distale della cartuccia (r=R', z=L), cioè nel punto meno ossigenato: ������������������������������������������������ =0.195 ������������ ������������������������������������ ������������������������ 3+0 .00025������������ ������������������������������������ ������������������������ 3∙������������ 2∙2∙10 −3 ������������������������ 2 ������������ �1 2 ( 3.2 2������������������������ 2−3 2������������������������ 2) −3.2 2������������������������ 2ln3 .2������������������������ 3������������������������ � −0 .00025������������ ������������������������������������ ������������������������ 3∙������������ 0.0303������������������������ ������������ ��3 .2������������������������ 3������������������������ � 2 −1 �180������������������������ ~������������.������������������������������������������������ ������������������������������������ ������������������������ 3 Questa concentrazione corrisponde ad una pressione parziale di ossigeno pari a: ������������= ������������∙������������ ---> ������������ ������������������������������������������������ ������������ = 0.008 ������������ 3 1.3 ������������������������������������������������������������ ∙ ������������������������ 3 10 −3 ������������������������ = 10 5 ) Quali parametri di progetto potrebbero essere modificati per aumentare la concentrazione nel punto meno ossigenato? [SOLUZIONE] • Lunghezza della fibra • Diametro della fibra, distanza fra le fibre • portata (o velocità del medium) Ogni modifica applicata a tali parametri dovrebbe poi essere seguita da una revisione del progetto della cartuccia, per verificare che le specifiche di progetto siano ancora soddisfatte nella nuova condizione. 6) Agendo su un parametro di progetto, cercare di mantenere almeno 1%∙������������ [SOLUZIONE] Tra le scelte possibili, agire sulla lunghezza della fibra o sulla portata media (o velocità) ha un effetto facilmente prevedibile, poiché entrambi tali parametri compaiono solo nel termine di decadimento assiale dell'equazione di Krogh-Blum. Si supponga, per esempio, di agire sulla lunghezza della fibra. Calcoliamo L max per ottenere ������������ ������������������������������������ =������������ ������������ �1 2( ������������′ 2−������������ 2) −������������ ′2 ln ������������′ ������������ �−������������ v ��������������� ′ ������������ � 2 −1 ������������� ������������ �1 2( ������������′ 2−������������ 2) −������������ ′2 ln ������������′ ������������ � ������������ v��������������� ′ ������������ � 2 −1 � 11 7 ) Confrontando la produzione di urea di questo BAL con quella di un fegato naturale, è possibile replicarne la funzionalità fisiologica? Si consideri che il tasso di produzione di urea per un epatocita è: ������������ ������������������������������������������������������������������������������������ e la produzione di urea fisiologica media è 65 ℎ DATI ������������ ������������=10 10 ������������������������ ℎ∙������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ℎ [SOLUZIONE] La produzione di urea fisiologica giornaliera è: ������������ ������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ =65 ������������������������ ℎ ∙24ℎ������������ =1560 ������������������������ ������������ =1,56 ������������ ������������ ������������ ������������=10 10 ������������������������ ������������ ������������������������������������������������ ������������������������������������ =������������ ������������������������������������������������ ∙������������ ������������=6.08∙10 −12 ������������ ℎ∙������������������������������������������������������������������������������������ ∙10 10 ������������������������������������������������������������������������������������=0.0608������������ ℎ =60.8������������������������ ℎ ∙24ℎ ������������ =1492.2������������������������ ������������ =������������.������������������������������������������������������������ ������������ Sulla base dei nostri calcoli, pertanto, questo BAL è quasi in grado di replicare la funzionalità fisiologica di un fegato sano.