logo
  • userLoginStatus

Welcome

Our website is made possible by displaying online advertisements to our visitors.
Please disable your ad blocker to continue.

Current View

Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

ese03-ITA

Other

26.09.2022 Esercitazione 3 TMR[1] 1. Terapia rigenerativa per la ghiandola mammaria Si consideri una terapia per la rigenerazione della ghiandola mammaria. La strategia terapeutica consiste nell'isolamento di cellule mesenchimali stromali da una biopsia di tessuto adiposo, nella loro espansione in vitro, nel loro differenziamento in adipociti, nella loro semina in una sfera solida costituita da un idrogel e nell'impianto ortotopico del costrutto cellularizzato. Il costrutto ha raggio R, e la concentrazione di nutrienti all'esterno del costrutto è costante ed uguale a C. Il coefficiente di diffusione dell'ossigeno nel costrutto cellularizzato è pari a D. La concentrazione minima per garantire una sufficiente ossigenazione delle cellule è c min = C/10. Le cellule consumano ossigeno ad una velocità costante, V. Ad oggi, questo prodotto terapeutico è stato approvato per la commercializzazione ed è diffuso in uso clinico. L'unica alternativa per la ricostruzione mammaria è l'impianto di protesi mammarie sintetiche. Rispondere brevemente alle domande proposte in tabella: Qual è il prodotto terapeutico? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs può essere collocato questo PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? r R D C 2. Espansione cellulare in un monostrato Una nuova terapia per l'artrosi si basa sull'utilizzo di condrociti, isolati, espansi in coltura e iniettati ripetutamente nei pazienti. Le cellule vengono espanse in un monostrato sul fondo di piastre Petri. Il monostrato cellulare viene mantenuto in coltura statica ricoperto da uno strato di terreno di coltura di spessore s. La pressione parziale dell'ossigeno presente nell'atmosfera dell'incubatore è Po. Il flusso di ossigeno sulle cellule è noto ed è pari a J c. Il coefficiente di diffusione dell'ossigeno nel terreno di coltura a 37°C è pari a D, il coefficiente di solubilità dell'ossigeno nel terreno a 37°C è pari a α. Si può assumere una simmetria piana per la concentrazione di ossigeno nel mezzo di coltura. Questa terapia è stata testata con successo sui primi 10 pazienti umani e la terapia convenzionale è l'artroplastica con protesi artificiale. Rispondere brevemente alle domande proposte in tabella: Qual è il prodotto terapeutico? Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs può essere collocato questo PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicit�)? X=s X=0 Classifica tutte le fonti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellulare (basata sull’immunogenicità) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità E’ utilizzabile rispetto alla terapia convenzionale? Perchè? 3. Si calcoli quanti cuori bioartificiali possono essere prodotti da una cell factory in un anno per soddisfare completamente la richiesta di trapianti. Si ipotizzi il tempo di decellularizzazione nullo (i cuori decellularizzati sono conservati e congelati pronti all’uso), il tempo di ricellularizzazione tcell = 10 giorni/cuore e i giorni lavorativi all’anno t work = 220 giorni/anno. Supponiamo di trattare tutti i pazienti statunitensi in attesa di trapianto N = 2640. Dati: t start = 0 (tempo di decellularizzazione iniziale) t cell = 10 giorni/cuore (tempo di ricellularizzazione) t work = 220 giorni/anno (giorni lavorativi) N = 2640 (pazienti USA in attesa di trapianto) 4. Semina/diluizione cellulare Si consideri di avere 10 6 cellule diluite in 1 ml di terreno di coltura. Supponiamo che l'area della singola cellula in adesione sia 180 µm 2. Si deve cellularizzare un vetrino coprioggetto con un'area di 1 cm 2. a. Si calcoli l'area del vetrino coprioggetto in µm 2. b. Quante cellule è necessario seminare sul vetrino coprioggetto per avere una confluenza cellulare del 70%? c. Quanti µl devono essere prelevati dalla soluzione madre di cellule? d. Se il volume finale della semina cellulare è 1 ml, quanti µl di terreno di coltura devono essere aggiunti alla soluzione finale di cellule? Figura - Protocollo di semina cellulare Dati: ������������ 0= 10 6 ������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ������������ = 1 ������������ 5. Numero di adesioni focali Si consideri un fibroblasto sulla superficie di un microbioreattore in terreno di coltura (µ= 1cP), sottoposto a un flusso planare di Couette generato dalla parete superiore, distante h= 100 µm dalla cellula e che si muove con una velocità U M = 400 mm/s, come mostrato in figura. Si scriva l'equazione per lo sforzo di taglio che agisce sulla cellula. Nell'ipotesi che la cellula in adesione possa essere rappresentata come un rettangolo piano (50x100 µm), si stimi il numero minimo di adesioni focali di cui la cellula necessita per resistere alla forza generata dal flusso (forza generata da una singola adesione focale f = 5nN). 6. Rigenerazione di un organo Per ripopolare un cuore di scimmia adulto decellularizzato sono necessarie 10 11 cellule. Si supponga di utilizzare cellule staminali mesenchimali (MSC), ottenute dal midollo osseo e differenziate in vitro. La densità di MSC nell'aspirato (volume = 0,5 ml) è 0.8*10 6 ������������������������������������������������������������������������������������ ������������ ������������3. L'efficienza del protocollo di isolamento delle cellule è bassa (0,02%). Il tempo di divisione delle MSC è 12h. Si calcoli il tempo di espansione cellulare in giorni. 7. Semina di cellule su scaffold Si considerino diversi scaffolds di forma cilindrica caratterizzati dai seguenti parametri a) Si calcoli il numero di cellule da seminare su ogni scaffold per ottenere una densità cellulare uguale alla densità ρ _fin = 10 9 cellule ������������������������ b) Si assuma di isolare cellule da una biopsia con un volume V = 8mm 3, ρ _biopsia =10 9 cellule ������������������������ . Conoscendo il tempo di divisione cellulare pari a t d= 24h, si calcoli il tempo di espansione necessario per ottenere un numero sufficiente di cellule da seminare su ciascuno scaffold alla densità citata precedentemente. SCAFFOLD DIAMETRO (mm) SPESSORE (mm) A 16 0.2 B 6.3 5 C 16 1.2 D 16 2 26.09.202 2 Soluzione E sercitazione 3 TMR[1] 1. Terapia rigenerativa per la ghiandola mammaria Si c onsider i una terapia per la rigenerazione della ghiandola mammaria. La strategia terapeutica consiste nell'isolamento di cellule mesenchimali stromali da una biopsia d i tessuto adiposo, nella loro espansione in vitro , nel loro differenziamento in adipociti , nella loro semina in una sfera solida costituita da un idrogel e nell'impianto ortotopico del costrutto cellularizzato. Il costrutto ha raggio R, e la concentrazione di nutrienti all'esterno del costrutto è costante ed uguale a C. Il coefficiente di diffus ione dell'ossigeno nel costrutto cellularizzato è pari a D. La concentrazione minima per garantire una sufficiente ossigenazione delle cellule è cmin = C/ 10. Le cellule consumano ossigeno a d una velocità costante, V. Ad oggi, questo prodotto terapeutico è stato approvato per la commercializzazione ed è diffuso in uso clinico. L'unica alternativa per la ricostruzione mammaria è l'impianto d i protesi mammarie sintetiche. Rispondere brevemente alle domande proposte in tabella: Qual è il prodotto terapeutico? Lo scaffold cellularizzato che consi ste nell’idrogelo + cellule staminali mesenchimali derivanti da tessuto adiposo differenziate in adipociti . Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? Il principale agente terapeutico utilizzato sono l e cellule MSC, ottenute dopo una “non -minima manipolazione” che consiste nell’isolamento, nella espansione in vitro nel differenziamento e nella semina in idrogel . In quale fase del processo regolatorio per nuovi P TC s può essere collocato questo PTC? Commercializzazione Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Current Good Manufacturing Practice (cGMP) Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Reazione Immunologica: SI, non si c onosce la sorgente cellulare Formazione di tumore : SI , per i fattori di differenziamento e dalla degradazione dell’ idrogelo . Trascurabile per le MSC Formazione di teratoma : NO, a meno che non si usino cellule staminali pluripotenti differenziate in MSC /adipociti Trasmissione di infezioni : SI sempre dal materiale prelevato dal donatore e dalla manipolazione cellulare Somministrazione di contaminanti tossici : SI sempre dal materiale prelevato dal donatore e dalla manipolazione cellular e r R D C 2. Espansione cellulare in un monostrato Una nuova terapia per l'artrosi si basa sull'utilizzo di condrociti, isolati, espansi in coltura e iniettati ripetutamente nei pazienti. Le cellule vengono espanse in un monostrato sul fondo di piastre Petri. Il mon ostrato cellulare viene mantenuto in coltura statica ricoperto da uno strato di terreno di coltura di spessore s. La pressione parziale dell'ossigeno presente nell'atmosfera dell'incubatore è Po . Il flusso di ossigeno sulle cellule è noto ed è pari a Jc. Il coefficiente di diffusione dell'ossigeno nel terreno di coltura a 37°C è pari a D, il coefficiente di solubilità dell'ossigeno nel terreno a 37°C è pari a α. Si può assumere una simmetria pian a per la concentrazione di ossigeno nel mezzo di coltura. Questa terapia è stata testata con successo sui primi 10 pazienti umani e la terapia convenzionale è l'artroplastica con protesi artificiale. Rispondere brevemente alle domande proposte in tabella: Qual è il prodotto terapeutico? Il prodotto terapeutico è l’iniezione di condrociti. Quali sono gli elementi che identificano il prodotto terapeutico come PTC? Il principale agente terapeutico utilizzato sono l e cellule, ottenute dopo una “non -minima manipolazione” che consiste nell’isolamento, nella espansione in vitro in Petri dove le cellule possono aderire e proliferare . In quale fase del processo regolatorio per nuovi P TC s può essere collocato questo PTC? Trial sull’uomo – Fase Clinica I (conosciuta anche come studio pilota) Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Good Manufacturing Practice (GMP) per la produzione del PTC Good Clinical Practice (GCP) per il suo trial clinico Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Reazione Immunologica: SI, perché non si conosce la sorgente cellulare Formazione di tumore : NO , perché non sono cellule multipotenti Formazione di teratoma : NO, perché si usano cellule unipotenti. (Sarebbe un rischio plausibile se si usassero cellule staminali pluripotenti differenziate in condrociti ) Trasmissione di infezioni : SI , dovuto sia al materiale prelevato dal donatore e dalla sua manipolazione Somministrazione di contaminanti tossici : SI , sempre dal materiale prelevato dal donatore e dalla manipolazione cellulare X=s X=0 Classifica tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellulare (basata sull’immunoge nicità) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità È utilizzabile rispetto alla terapia convenzionale ? Perchè? Autologa Condrociti isolate dal paziente ed espansi __ _____ _ MSC isolate dal paziente e differenziate (terapia ACI/MAC attualmente in uso) Compatibilità immunologica No rischio di tumore ____ ___ _ Compatibilità immunologica Rischio di tumore: trascurabile Disponibilità limitata Espandibilità limitata Test invasivo _____ Disponibilità limitata Espandibilità limitata Test invasivo YES Autologa Cellule pluripotenti indotte (iPS) prelevate dalle cellule somatiche del paziente, differenziate (successivamente in condrociti ) Compatibilità immunologica - Limitazione di protocolli di re - differenziamento - Rischio di teratoma NO Rischio di teratoma Singenica Cellule Staminali Embrionali isolate da cloni del paziente e differenziate (in condrociti ) Compatibilità immunologica ad eccezione del DNA mitocondriale - Limitazioni etiche, tecnic he, regolatorie per l’utilizzo di cloni cellulari - Limitazioni nei proto colli di differenziamento - Rischio di teratoma NO Rischio di teratoma Allogeneica Condrociti isolati da un donatore adulto ed espansi - Disponibilità con cellule HLA compatibili - Può essere industrializzato - NO rischio di tumori Immunogenicità NO Immunogenicità Xenogenica Condrociti isolat i da un donatore non umano ed espansi - Grande disponibilità da animali viventi Può essere industrializzato - NO rischio di tumori - Rischio di una reazione immunitaria acuta - Rischio di xeno - zoonosi - Limitata funzionalità biologica NO Rischio di reazione immunitaria 3. Si c alcol i quanti cuori bioartificiali possono essere prodotti da una cell factory in un anno per soddisfare completamente la richiesta di trapianti . Si ipotizzi il tempo di decellularizzazione nullo (i cuori decellularizzati sono conservati e congelati pronti all’uso), il tempo di ricellularizzazione t cell = 10 giorni/cuore e i giorni lavorativi all'anno t work = 220 giorni/anno. Supponiamo di trattare tutti i pazienti statunitensi in attesa di trapianto N = 2640. Dati: tstart = 0 (tempo di decellularizzazione iniziale) tcell = 10 giorni/cuore (tempo di ri cellularizzazione) twork = 220 giorni/anno (giorni lavorativi) N = 2640 (pazienti USA in attesa di trapianto) Soluzione: Numero di cuori prodotti in un anno (in serie): � = ����� ����� = 220 ���������������� ��������� 10 �������������� ℎ��������� = 22 ���������� ��������� Il numero di anni necessari per esaurire completamente la lista di attesa o il numero di cuori che devono essere prodotti simultaneamente sono: � = ������ � = 2640 22 = 120 4. Semina/diluizione cellulare Si consideri di avere 10 6 cellule diluite in 1 ml di terreno di coltura. Supponiamo che l'area della singola cellula in adesione sia 180 µm 2. Si deve cellularizzare un vetrino coprioggetto con un'area di 1 cm 2. a. Si calcoli l'area del vetrino coprioggetto i n µm 2. b. Quante cellule è necessari o seminare sul vetrino coprioggetto per avere una confluenza cellulare del 70%? c. Quanti µl devono essere prelevati dalla soluzione madre di cellule? d. Se il volume finale della semina cellulare è 1 ml, quanti µl di terreno di coltura devono essere aggiunti alla soluzione finale di cellule? Figura - Protocollo di semina cellulare Dati: �0= 10 6 ������� ������� = 1 �� Area della cellula ������� = 180 µ� 2 Area del substrato ������� = 1 �� 2 �������������� = 70% ������� �� = 1 �� Soluzione a. Calcolare l’area del vetrino coprioggetto in µm 2 ������� = 1 �� 2= 10 8µ� 2 (1 �� = 10 4µ� ) b. Quante cellule è necessario seminare su un vetrino coprioggetto per avere una confluenza del 70%? Area da ricoprire : �������������� = 70% �������= 0.7∗10 8µ� 2= 70 ∗10 6 µm 2 Numero di cellule che devono essere seminate: �� = ��������� ������� = = 70∗106 µ�2 180 µ�2 = 0.38 ∗10 6  39 ∗10 4 ������� c. Quanti µl devono essere prelevati dalla soluzione madre di cellule? La domanda reale è: qual è il volume che contiene 39 ∗10 4 ������� ? 10 6 ����� ∶ 1000 µ� = 39 ∗10 4 ����� ∶ ������ ������� �������������� → �� = 390 µ� d. Se il volume finale della semina cellulare è 1 ml, quanti µl di terreno di coltura devono essere aggiunti alla soluzione finale di cellule? Volume da aggiungere alla soluzione cellulare: � = �� − ��= 1000 µ� – 390 µ�= 610 µ� di mezzo di coltura . 5. Numero di adesioni focali Si consideri un fibroblasto sulla superficie di un microbioreattore in terreno di coltura (µ= 1cP), sottoposto a un flusso planare di Couette generato dalla parete superiore, distante h= 100 µm dalla cellula e che si muove con una velocità U M = 400 mm/s, come mostrato in figura. Si scriva l'equazione per lo sforzo di taglio che agisce sulla cellula. Nell'ipotesi che la cellula in adesione possa essere rappresentata come un rettangolo piano (50x100 µm), si stimi il numero minimo di adesion i focal i di cui la cellula necessita per resistere alla forza generata dal flusso (forza generata da una singola adesione focale f = 5nN). Soluzione L’equazione generale per il calcolo dello sforzo di taglio alle pareti è : ������ = µ�������� ������� In questo caso particolare, il gradiente di velocità può essere semplificato usando la pendenza del profilo di velocità lineare, quindi lo sforzo di taglio può essere calcolato come: ������ = µ������� ℎ (dove [µ]= cP= 10−3�� �2 ) La forza di taglio che a gisce sulla cellul a è data dallo sforzo di taglio moltiplicato per l’area che la cellula stessa espone al flusso: ����������������� = µ�� ℎ ������ Dove A è stimato essere l’area della cellula (forma rettangolare): ������ = 5∗10 −9 � 2. ����������������� = µ������� ℎ ������ = 10−3�� �2 4∗10−1� � 1 10−4� 5∗10 −9 � 2 =2 ∗10 −8������ Questa forza è contrastata da l numero d i adesion i focali che la cellula possiede. Quindi tale numero è dato da : ��������� = �������������������������������� � = 2∗10−8� 5∗10−9�= 0.4∗10 = 4 oppure : ��������� = �������������� ℎ� = 10 −3������� � 2 ∙4∗10 −1� � ∙5∗10 −9� 2 10 −4� ∙5∗10 −9������ = 4 6. Rigenerazione di un organo Per ripopolare un cuore di scimmia adulto decellularizzato sono necessarie 10 11 cellule. Si supponga di utilizzare cellule staminali mesenchimali ( MSC ) ottenute dal midollo osseo e differenziate in vitro in cardiomiociti . La densità di MSC nell'aspirato ( Volume aspirato = 0,5 ml) è 0.8*10 6 ������� ��3. Si tenga conto del fatto che l 'efficienza del protocollo di isolamento delle cellule è bassa (0 ,02%). Il tempo di divisione delle MSC è 12h. Si calcoli , in giorni , il tempo di espansione cellulare. Soluzione t = t d*d n = Vol * ������ Il numero finale delle cellule è: ��=10 11 cell ule Il numero di cellule nell’aspirato è: n= ������ * V= 0.8*10 6 ������� �� 3 * 0.5*10 3mm 3= 0.4 *10 9=400 *10 6 cell ule L’efficienza del protocollo è 0.02% Il numero di cellule isolate ottenute durante l’isolamento è: Xi = 0.02%*400*10 6 cells = 2*10 -4*400*10 6 cells = 0.08*10 6 cell ule ������� ������������ = 1011 0.08∗106= 1.25*10 6 d = ln (1.25∗106) ln2 = ln (1.25∗106) 0.69 = 20.25 ~ 20 Il tempo di espansione è: � = � * �� = 20*12 = 240ℎ * 1 giorno 24 ℎ = 10 giorni 2 ln ln       = o f X X d 7. Semina di cellule su scaffold Si considerino diversi scaffolds di forma cilindrica caratterizzati dai seguenti parametri a) Si calcoli il numero di cellule da seminare su ogni scaffold per ottenere una densità cellulare pari a _fin = 10 9 cellule �� b) Si assuma di isolare cellule da una biopsia con un volume V = 8mm 3, _biopsia =10 9 cellule �� . Conoscendo il tempo di di visione cellulare , che è pari a td= 24h, si calcoli il tempo di espansione necessario per ottenere un numero sufficiente di cellule da seminare su ciascuno scaffold alla densità citata precedentemente. Soluzione : a) SCAFFOLD Raggio (mm) Spessore (mm) Volume (mm 3)= π*(diametro /2) 2 * spessore A = 16/2 0.2 40.2 B = 6.3/2 5 155.86 C = 16/2 1.2 241.27 D = 16/2 2 402.12 La densità cellulare richiesta per ogni scaffold è:  = ������� � Il numero finale di cellule per ogni scaffold è: ��= � ∗ ��� = �� ∗�������� = 40 .2 � � 3∗10 6������� � � 3 = 40 .2∗10 6 ������� ��� = �� ∗�������� = 155 .86 � � 3∗10 6������� � � 3 = 155 .86 ∗10 6 ������� ��� = �� ∗�������� = 241 .27 � � 3∗10 6������� � � 3 = 241 .27 ∗10 6 ������� ��� = �� ∗�������� = 402 .12 � � 3∗10 6������� � � 3 = 402 .12 ∗10 6 ������� SCAFFOLD DIAMETRO (mm) SPESSORE (mm) A 16 0.2 B 6.3 5 C 16 1.2 D 16 2 ��������� = �������� ∗ ��������� b) Solu zione : Tempo di duplicazione �� = 24ℎ Densità cellulare della biopsia ����������������� = 10 9������� �� = 10 6������� ��3 Volume biopsia V = 8 mm 3 Cellule isolate da una singola biopsia : �0= ����������������� ∗� = 10 6������� ��3 ∗8 � � 3 = 8∗10 6 ������� Duplicazioni : ��= ln (40 .2∗10 6 8∗10 6 ) ln 2 = ln (5.03 ) 0.69 = 1.61 0.69 = 2.3 ��= ln (155 .86 ∗10 6 8∗10 6 ) ln 2 = ln (519 .5) 0.69 = 2.97 0.69 = 4.3 ��= ln (241 .27 ∗10 6 8∗10 6 ) ln 2 = ln (30 .16 ) 0.69 = 23 .497 0.69 = 4.9 �� = ln (402 .12 ∗10 6 8∗10 6 ) ln 2 = ln (50 .2) 0.69 = 3.92 0.69 = 5.6 Tempo di espansione cellulare : �= � ∗�� Se considero gli scaffold separatamente: ��= 24ℎ ∗2.3 = 55 .2ℎ = 2.3 ���������������� ��= 24ℎ ∗4.3 = 103 .2ℎ = 4.3 ���������������� ��= 24ℎ ∗4.9 = 117 .6ℎ = 4.9 ���������������� �� = 24ℎ ∗5.6 = 134 .4ℎ = 5.6 ���������������� X0=*V Le duplicazioni sono: Il tempo di espansione cellulare è pari a: . d f X X 2 0 = d f X X 2 0 = ( ) 2 ln 2 ln ln d X X d o f = =      2 ln ln       = o f X X d ddt t= Se voglio seminare tutti gli scaffold contemporaneamente: ��= ���+ ���+ ���+ ���= 839.25* 10 6 ������� � = ln (839 .25 ∗10 6 8∗10 6 ) ln 2 = ln (104 .9) 0.69 = 4.6 0.69 = 6.7 �= 24ℎ ∗6.7 = 160 .8ℎ = 6.7