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Biomedical Engineering - Technology for Regenerative Medicine

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1 Rigenerazione dello Stomaco: Stomaco Murino Ingegnerizzato dimostra il Differenziamento Epiteliale 1) Speer et al. hanno isolato cellule epiteliali da uno stomaco neonatale e le hanno seminate su uno scaffold poroso a base di acido poliglicolico (PGA). Lo scaffold seminato viene impiantato in un topo adulto per una settimana. La cellularizzazione dello scaffold è stata valutata con un’istologia. Rispondere alle domande nella tabella: Qual è il prodotto terapeutico sopra descritto? Quali sono gli elementi che identificano questo prodotto terapeutico come PTC? In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs pu� essere collocato questo PTC? Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicit�)? 2 Classificare tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellular e (basata sull� immunogenic it�) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità 3 2) L’acido poliglicolico (PGA) è uno scaffold con una porosità del 95%. È stato cellularizzato con una densità cellulare di (0.019±0.007) * 10 6������������������������������������������������������������ ������������������������ 3. Lo scaffold può essere modellato come un cilindro cavo con un’altezza di 3 mm (H = 3 mm), raggio interno di 2.25 mm (R inC ) e raggio esterno di 4.25 mm (R outC ). Dopo la semina e prima dell’impianto i ricercatori devono mantenere lo scaffold in 5 ml di medium standard (Vol medium ), continuamente rimescolato. Quanto tempo lo scaffold può essere mantenuto nel medium rimescolato senza raggiungere la condizione di ipossia? Dopo averla calcolata, si disegni il grafico del profilo della concentrazione di ossigeno. Si considerino inoltre i seguenti dati: - V max (caso peggiore di consumo di ossigeno dato dalla densità cellulare massima N i(max) ); - c 0 = 0.2 ������������������������������������������������ ������������������������ (concentrazione iniziale) - K m= 0.15 ������������������������������������������������ ������������������������ (saturazione costante) - Consumo cellulare di ossigeno: V cell = 0.18 ������������������������������������������������ ������������∗������������������������������������������������������������������������������������������������ - Condizione di ipossia: c = 0.1*c 0 - Vol medium = 5 ml 4 3) Una volta impiantato, lo scaffold assume una configurazione sferica: la sfera ha un raggio interno di 1.13 mm (R inS ) e lo spessore è di 2 mm (R outS = R inS + 2 mm = 3.13 mm). In questo modo, il volume della sfera e del cilindro sono uguali. Si ipotizzi che la pO 2 venosa sia uguale a 40 mmHg sia alla parete interna che esterna. Si consideri D O2 all’interno dello scaffold pari a 8*10 -5 ������������������������ ������������ ������������ . Si calcoli il profilo di concentrazione c(r) condizioni stazionarie e simmetria sferica. Si calcoli la regione dello scaffold in cui la concentrazione di ossigeno è sopra il valore critico (c(r) > 0.1*c 0) e la frazione dello scaffold che e’ ossigenata. 5 4) Dall’istologia dopo 1 settimana è possibile stimare una densità cellulare di 0.79 106cells mm3 . Si calcoli il numero di cellule presenti inizialmente nel volume dello scaffold dove la condizione c(r) > 0.1*c 0 è soddisfatta (V o2). Si consideri un tempo di doubling (t d) di 24 ore. Usando questi dati, si calcoli il numero teorico finale di cellule. Si confronti la densità cellulare finale (usando V o2), con quella stimata. Si provi a spiegare il risultato ottenuto. Cosa si pensa possa essere modificato per raggiungere un sistema di rigenerazione più performante? 1 Rigenerazione dello Stomaco: Stomaco Murino Ingegnerizzato dimostra il Differenziamento Epiteliale 1) Speer et al. hanno isolato cellule epiteliali da uno stomaco neonatale e le hanno seminate su uno scaffold poroso a base di acido poliglicolico (PGA). Lo scaffold seminato viene impiantato in un topo adulto per una settimana. La cellularizzazione dello scaffold è stata valutata con un’istologia . Rispondere alle domande nella tabella: Qual è il prodotto terapeutico sopra descritto? Scaffold poroso di PGA cellularizzato con cellule epiteliali Quali sono gli elementi che identificano questo prodotto terapeutico come PTC? Il principale agente terapeutico utilizzato sono le cellule, ottenute dopo una “non -minima manipolazione ” che consiste nell’isolamento ed espansione . In quale fase del processo regolatorio per nuovi PTCs può essere collocato questo PTC? Trial su animali Quali sono gli standard che si applicano a questo stadio del processo di sviluppo del PTC? Good Manufacturing Practice (GMP) Good Clinical Practice (GCP) Quali sono i rischi associati a questo PTC (immunogenico, tumore, teratoma, infezione, tossicità)? Reazione immunologica : SI, la sorgente cellulare non e’ autologa ( ricevent e = topo adulto) . Formazione di tumore: SI, dallo scaffold e dalle nicchie d i cellule staminali presenti nel tessuto prelevato . Formazione di teratoma: NO, a meno che non si usino delle cellule pluripotenti differen ziate in cellule epiteliali . Trasmissione di infezioni: SI, dal materiale prelevato dal donatore o da qualsiasi manipolazione . Somministrazione di contaminanti tossici : SI, dalla manipolazione cel lulare e dalla degradazione dello scaffold . 2 Classifica re tutte le sorgenti cellulari potenzialmente utilizzabili in pazienti umani per questa terapia Fonte cellular e (basata sull’ immunogenic ità) Tipo/i cellulare Vantaggi Criticità Autologa Cellule epiteliali isolate dallo stomaco dal paziente (ed espanse) Compatibilità immunologica Disponibilità ed espandibilità limitate Procedura invasiva Autologa Cellule pluripotenti indotte (iPS) da cellule somatiche del paziente e ri - differenziate (in cellule epiteliali ) Compatibilità immunologica Limiti nei protocolli di ri -differenziamento Rischio di teratoma Singenica Cellule staminali embrionali isolate da cloni del paziente e differenziate (in cellule epiteliali ) Compatibilità immunologica ad eccezione del DNA mitocondriale Limitazioni etiche, tecniche, regolatorie per l’utilizzo di cloni cellulari Limiti nei protocolli di differenziamento Rischio di teratoma Allogenica Cellule epiteliali isolate da donatore umano (ed espanse ) Può essere industrializzato Abbastanza disponibile, considerato il solo utilizzo delle cellule che presentano la corrispondenz a degli antigeni de i leucociti umani (HLA) Rischio di reazione immunitaria Rischio di tumore da cellule staminali presenti in questo tipo di tessuto Xenogenica Cellule epiteliali isolate da donatore non umano (ed espanse ) Elevata disponibilità da animali Può essere industrializzato Rischio di reazione immunitaria acuta Rischio di xeno -zoonosi Funzionalità biologica limitata Rischio di tumore da cellule staminali presenti in questo tipo di tessuto 3 2) L’acido poliglicoli co (PGA) è uno scaffold con una porosità del 95%. È stato cellularizzato con una densità cellulare di (0.019±0.007)* 10 6����� �� 3. Lo scaffold può essere modellato come un cilindro cavo con un’altezza di 3 mm (H = 3 mm), raggio interno di 2.25 mm (R inC ) e raggio esterno di 4.25 mm (R outC ). Dopo la semina e prima dell’impianto i ricercatori devono mantenere lo scaffold in 5 m l di medium standard (Vol medium ), continuamente rimescolato. Quan to tempo lo scaffold può essere mantenuto nel medium rimescolato senza raggiungere la condi zione di ipossia? Dopo averla calcolata, si disegn i il grafico del profilo della concentrazione di ossigeno. Si considerino inoltre i seguenti dati : - Vmax (caso peggiore di consum o di ossigeno dato dalla densità cellulare massima Ni(max) ); - c0 = 0.2 ��������� �� (concentrazione iniziale ) - Km= 0.15 ��������� �� (saturazione costante) - Consumo cellulare di ossigeno : V cell = 0.18 �������������� ������∗���������������������������� - Condizione di ipossia: c = 0.1*c 0 - Volmedium = 5 ml DATI: - Porosità dello scaffol d: 95% - Densità cellulare massima: Ni = Ni(max) = (0.019+ 0.007 ) 10 6����� �� 3 = 0.026 *10 6����� �� 3 - Altezza dello scaffold : H = 3 mm - Raggio interno dello scaffold : R inC = 2.25 mm - Raggio esterno dello scaffold : R outC = 4.25 mm - Vmax (caso peggiore di consum o di ossigeno dato dalla densità cellulare massima Ni(max) ) - c0 = 0.2 µmol/ml (concentrazione iniziale ) - Km = 0.15 µmol/ml ( saturazione costante ) - Consumo cellulare di ossigeno : V cell = 0.18 ��������� ℎ∗106����� ; - Condizione di ipossia: c = 0.1*c 0 - Vol medium = 5ml SOLUZIONE: Calcolare la riduzione della concentrazione di ossigeno nel volume di controllo usando il modello compartimentale del trasporto di massa : �� �� ∗�������� ����������� = ���������������� − ���� ���� + �− � dove : Qin e Qout sono le portate che entrano ed escono nel volume di controllo (Qin = Q out =0) P è l’ossigeno prodotto nel volume di controllo (p = 0) � è il consumo di ossigeno nel volume di controllo : �= ������ ∗�������� �������� Considerando le ipotesi , l’equazione semplificata è: 4 �� �� ∗�������� ����������� = −������ ∗�������� �������� dove Volmedium è il volume di medium e il consumo V ha espressioni diverse in base alla concentrazione di (cinetica Michaelis -Menten) . ������ = �������������� ∗ � �� + � a) se c ≥ K m, V = Vmax b) se c < K m, V = (������������������� �� )*c Dove Vmax ha la seguente espressione : �������������� = ������������ ���������� (1− ������) ε è la frazione non consuma nte . In questo caso , dal momento che la porosità è 95% , la frazione non consumante è 5%. Perciò , 1-ε corrisponde a 0.95. Vcell è il consumo cellulare di ossigeno = 0.18 µmol 106 ����� ∗ℎ Il caso peggiore di consumo di ossigeno si verifica quando la densità cellulare è massima: Ni = 0.026 *10 6����� �� 3 [NB: 1ml = 1000 mm 3] Quindi , �������������� = ���������������������� (1− ������)= 0.026 10 6 ����� �� 30.18 µ��� 10 6 ����� ∗ℎ 0.95 = 0.004446 µ��� �� 3∗ℎ 10 3�� 3 �� ℎ 3600 �= 0.00123 µ��� �� ∗� Volscaffold è il volume dello scaffold (cilindro cavo) e la sua espressione è : �������� �������� = (����� 2− ��������� 2)������∗������ = (18 .06 − 5.06 )������∗3 = 39 ������ �� 3 = 122 .5 �� 3 �� 10 3�� 3= 0.1225 �� Calcolare il tempo totale di storage (ts) come: �� = ���>������� + ���������� Quindi , �� �� ∗�������� ����������� = −�������������� ∗�������� �������� Noi siamo interessati a trovare il tempo ���>������� a cui c = Km. �� = − �������������� ∗�������� �������� �������� ����������� ∗�� Integrando tramite separazione di variabile c(t) , l’espressione risulta : 5 �(�)= − �������������� ∗�������� �������� �������� ����������� ∗�+ � App licando la condizione iniziale c = c0 a t = 0 �(0)= �0= −�������������� ∗�������� �������� �������� ����������� ∗0+ � = � A = c0. �(�)= −�������������� ∗�������� �������� �������� ����������� ∗�+ �0 Il tempo � a cui c = Km è: �(���>�� )= ������� = −�������������� ∗�������� �������� �������� ����������� ∗���>�� + �0 ���>�� = (�0− ������� ) �������������� ∗�������� �������� ∗�������� ����������� = (0.20 − 0.15 )µ��� �� ∗5�� 0.00123 µ��� �� ∗� 0.1225 �� ≅ 1659 �≅ 27 �������� b. Per c < Km, Il profilo di concentrazione diminuisce dal valore Km a cmin V = (������������������� �� )*c c = Km a t’ = 0 (NB: per semplificare il calcolo è appropriato considerare il tempo iniziale ancora uguale a 0 ). Cal colare ��� 0.1*c 0 è soddisfatta (V o2). Si consideri un tempo di doubling (td) di 24 ore. Usando quest i dat i, si calcoli il numero teorico finale di cellule. Si confronti la densità cellulare finale (usando V o2), con quella stimata. Si provi a spiegare il risultato ottenuto. Cosa si pensa possa essere modificato per raggiungere un sistema di rigenerazione più pe rformante? DAT I: - Densità cellulare: Nisto = 0.79 106cells mm 3 - VolO2 = 10.21 mm 3 - td = 24 - Densità media precedentemente dichiarata : ������������= 0.019 106cells mm 3 SOLUZIONE : Il numero medio iniziale di cellule seminare nel Vol o2 dello scaffol d è: ������������= ������������∗�������� ������2= 0.019 10 6cells mm 3 ∗10 .21 �� 3= 0.19 x10 6cells Sapendo il tempo di doubling (t d = 24 ore), il numero teorico finale di cellule dopo una settimana sarà: T = td * d = t d ln(�������������������) ��2 ln (������� ������������ )= �� 2 � �� �������= ������������∗2 ���= 0.19 ∗10 6cells ∗2 16824 = 24 .32 ∗10 6cells �������= ������� �������� �2 = 24 .32 ∗10 6cells 10 .21 �� 3 = 2.38 10 6cells mm 3 È possibile notare che il numero teorico N f è divers o da quello stimato (N hysto = 0.79* 10 6cells mm 3 ). Una prima considerazione da fare è che le cellule in ipossia mandino segnali paracrini che influenz ino la sopravvivenza cellulare anche delle cellule che si trovano nella regione dello scaffold con sufficiente ossigenazione. Per questo motivo, in futuro, è necessario cambiare la geometria dello scaffold in modo che ci sia una frazione elevata di cellule ossigenata. Una possibile ulteriore spiegazione può essere aggiunta valutando se nell’arco di una settimana ci sia l’influenza negati va dei prodotti di degradazione dello scaffold che potreb bero interagire negativamente con il metabolismo cellulare causandone la morte.