Biomedical Engineering - Applicazioni Biotecnologiche e Bioreattori

Appunti completi del corso: Bioreattori

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POLITECNICO DI MILANO Master’s Degree in Biomedical Engineering ABB 2022/2023 – II semester Professor Pelegatta Bioreattori Appunti Index 1 Introduzione ai bioreattori - 1 6 1.1 Cos’`e un bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2 Ingegneria dei tessuti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2.1 Storia dell’ingegneria dei tessuti . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2.2 Recap ingegneria dei tessuti . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.3 Come progettare un bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.4 ECM e sca↵old . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.4.1 Tipologie di sca↵old . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.4.2 Progettazione dello sca↵old . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.5 Ruolo del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.5.1 Componenti del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2 Introduzione ai bioreattori - 2 11 2.1 Altri componenti dell’ingegenria dei tessuti . . . . . . . . . . . . 11 2.2 Utenti finali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.2.1 Quali sono gli obiettivi degli utenti target? . . . . . . . . 12 2.2.2 Come funziona l’EMA? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.3 Bioreattore per applicazione aziendale / clinica . . . . . . . . . . 15 2.3.1 Impatto di un bioreattore di questo tipo sulla produzione 16 2.3.2 Un concetto importante: scale up/scale out . . . . . . . 16 2.3.3 Caratteristiche dei bioreattori aziendali/clinici . . . . . . 17 2.4 Bioreattori per la ricerca . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.4.1 Caratteristiche di un bioreattore per la ricerca . . . . . . 19 3 Bioreattori a perfusione 20 3.1 Perfusione non confinata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2 Perfusione confinata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.3 Come la perfusione influisce sulla semina . . . . . . . . . . . . . 21 3.4 Caratteristiche principali dei bioreattori a perfusione . . . . . . 21 3.5 Esempio di bioreattore a perfusione . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.5.1 Il bioreattore U-Cup . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.5.2 Il bioreattore OPB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 3.6 Approfondiamo il progetto di un bioreattore . . . . . . . . . . . 24 3.6.1 Requisiti specifici per un bioreattore a perfusione . . . . 24 3.7 Schema a blocchi del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.7.1 Camera di coltura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.7.2 Sistema di ossigenazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1 3.7.3 Pompa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.7.4 Sensoristica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.7.5 Come viene progettata la linea di perfusione . . . . . . . 29 3.7.6 Specifiche del sistema di controllo . . . . . . . . . . . . . 29 3.7.7 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.7.8 Bioreattore assemblato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.8 Manuale d’uso per l’utente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.9 Validazione di un bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.9.1 Validazione ingegneristica . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.9.2 Validazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.10 Pro e Contro dei bioreattori a perfusione . . . . . . . . . . . . . 35 3.10.1 Pro dei bioreattori a perfusione . . . . . . . . . . . . . . 35 3.10.2 Contro dei bioreattori a perfusione . . . . . . . . . . . . 35 4 Controllo di un bioreattore 36 4.1 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4.2 Esempio di lavoro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4.3 Approccio a black box . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4.4 Definizione degli output . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4.4.1 Pompa peristaltica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4.4.2 Elettrovalvole pinza tubo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 4.4.3 Tapetino riscaldato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.4.4 Modulazione di larghezza di impulso (pulse Width mod- ulation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 4.5 Controllo della potenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 4.5.1 Logica vs Potenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.5.2 Cablaggio e custodia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.6 Unit`a centrale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 4.6.1 Arduino . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 4.7 Definizione degli input . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 4.8 Manuale d’uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.9 Esercizio esempio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.9.1 Soluzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 5 Monitoraggio del pH in bioreattori 48 5.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 5.2 Bioreattori come sistemi di controllo . . . . . . . . . . . . . . . 48 5.3 Tipologie di sensoristica utilizzabili . . . . . . . . . . . . . . . . 49 5.3.1 Indiretto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 5.3.2 Invasivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 5.3.3 Non Invasivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 5.3.4 Riassunto pro e contro sensoristica . . . . . . . . . . . . 51 5.4 Monitoraggio e controllo delle colture cellulari . . . . . . . . . . 51 5.5 Monitoraggio del pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 5.5.1 Proliferazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 5.5.2 Di↵erenziazione cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 5.5.3 Metabolismo cellulare . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 5.5.4 Sintesi proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 2 5.6 Esempio di monitoraggio di pH con ricambio manuale . . . . . . 54 5.7 Apparecchi per il monitoraggio del pH . . . . . . . . . . . . . . 54 5.7.1 Sonda (probe) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 5.7.2 Elaborazione del segnale e interfaccia utente . . . . . . . 55 5.7.3 Il software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56 5.7.4 Sistema di scambio automatico dei supporti . . . . . . . 56 5.7.5 Circuito di scambio del mezzo di coltura (pump 1 e 2) . 57 5.7.6 Sistema di scambio automatico dei supporti . . . . . . . 58 5.7.7 Riassunto del sistema ultimato . . . . . . . . . . . . . . 58 6 Bioreattore per muscolo scheletrico 60 6.1 Tessuto muscolare scheletrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 6.2 Stimolazione meccanica ed elettrica . . . . . . . . . . . . . . . . 62 6.2.1 Stimolazione meccanica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 6.2.2 Stimolazione elettrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 6.3 Esempio: Risposta dei mioblasti . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 6.4 Stato dell’arte di stimolatori meccanici . . . . . . . . . . . . . . 63 6.5 Specifiche di progetto del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . 63 6.6 Componenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 6.6.1 Camera del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 6.6.2 Sistema e procedure di supporto e inserimento . . . . . . 68 6.6.3 Stimolazione meccanica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 6.6.4 Stimolazione elettrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 6.6.5 Controller . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 6.7 Esperimento di coltura dinamica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 6.7.1 Condizionamento meccanico . . . . . . . . . . . . . . . . 73 6.7.2 Condizionamento elettromeccanico . . . . . . . . . . . . 73 7 Ingegneria tissutale per tessuti circolari 76 7.1 Perch´e abbiamo bisogno di innesti vascolari TE? . . . . . . . . . 76 7.2 Anatomia dei vasi sanguigni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 7.3 Approcci TE per gli innesti vascolari . . . . . . . . . . . . . . . 77 7.4 Specifiche di progettazione del bioreattore . . . . . . . . . . . . 77 7.5 Stato dell’arte di bioreattori tubolari . . . . . . . . . . . . . . . 78 7.5.1 Breath: primo bioreattore per ingegnerizzazione della trachea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 7.5.2 InBreath: secondo bioreattore per ingegnerizzazione della trachea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 7.6 Bioreattore MiniBreath . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 7.6.1 Componenti del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . 80 7.6.2 Criteri per la scelta del materiale . . . . . . . . . . . . . 83 7.7 Conclusioni e applicazioni future . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 8 Ingegneria tissutale (TE) per i tessuti vascolari 85 8.1 L’importanza dell’endotelio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 8.2 Bioreattori per la TE vascolare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 8.2.1 Caratteristiche fondamentali del bioreattore . . . . . . . 87 8.3 Patologia dei vasi sanguigni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 3 8.4 Approccio di ingegneria tissutale . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 8.5 Modello FSI del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 8.5.1 Configurazione del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . 88 8.5.2 Impostazione del modello . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 8.5.3 Pressione stimata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.5.4 Shear stress stimato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.6 Coltura di TEVG nel bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 8.6.1 Scopo del lavoro e razionale . . . . . . . . . . . . . . . . 92 8.6.2 Materiali e metodi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 9 Decellularizzazione e ingegneria tissutale degli organi 98 9.1 Argomenti trattati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 9.1.1 Sca↵old . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 9.1.2 Matrice extracellulare (EMC) . . . . . . . . . . . . . . . 98 9.2 Decellularizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 9.2.1 Pro degli sca↵old decellularizzati . . . . . . . . . . . . . 99 9.2.2 Contro degli sca↵old decellularizzati . . . . . . . . . . . . 100 9.2.3 Come si decellularizza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 9.3 Ingegneria dei tessuti arteriosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 9.3.1 Protocollo di decellularizzazione . . . . . . . . . . . . . . 100 9.3.2 Ricellularizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102 9.4 Ingegneria tissutale dell’esofago . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 9.4.1 Perch`e ingegnerizzarlo? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 9.4.2 Bioreattore dell’esofago . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 9.5 Ingegneria dei tessuti epatici (fegato) . . . . . . . . . . . . . . . 104 9.5.1 Motivazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 9.5.2 Come funziona . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 9.6 Gel decellularizzati derivati dalla ECM . . . . . . . . . . . . . . 106 9.6.1 Motivazioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 10 Bioreattori per organi interi 107 10.1 Organi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 10.2 Il fegato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 10.2.1 Funzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 10.3 Ingegneria dei tessuti epatici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 10.3.1 Lo sca↵old decellularizzato - protocollo . . . . . . . . . . 109 10.3.2 Lo sca↵old decellularizzato - Errori . . . . . . . . . . . . 110 10.3.3 Lo sca↵old decellularizzato - setup dinamico . . . . . . . 110 10.3.4 Lo sca↵old decellularizzato - analisi . . . . . . . . . . . . 111 10.4 Biorettaore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111 10.4.1 Bubble trap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 10.4.2 Dettagli della camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 10.4.3 Il sensore di pH-temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . 113 10.4.4 Risultati a livello biologico . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 10.5 Scaling Out del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 10.5.1 Dettagli della camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 10.5.2 Dettagli sull’alloggiamento del tessuto . . . . . . . . . . 115 10.6 Un modello in vitro per la somministrazione di virus . . . . . . 116 4 11 Design di un bioreattore 117 11.1 Scaletta per il design del bioreattore . . . . . . . . . . . . . . . 117 11.2 L’argomento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 11.3 Primo Task: Stato dell’arte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 11.3.1 Ricerca tramite immagine . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 11.4 Secondo e terzo Task: scrivere le specifiche di design e disegnare poi la camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 11.4.1 Secondo task: Specifiche di design . . . . . . . . . . . . . 121 11.4.2 Terzo task: disegno della camera . . . . . . . . . . . . . 121 11.5 Quarto Task: Circuito idraulico . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 11.6 Quinto Task: Sistema di controllo . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 12 Organi interi vascolarizzati 126 12.1 Organi e vascolarizzazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 12.2 Capillari . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 12.3 Primo esempio: la vascolarizzazione dell’intestino . . . . . . . . 126 12.3.1 Sca↵old decellularizzata . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126 12.3.2 Ricellularizzazione dell’epitelio . . . . . . . . . . . . . . . 128 12.3.3 Rivascolarizzazione dell’organo . . . . . . . . . . . . . . . 129 Bibliography 132 5 Chapter 1 Introduzione ai bioreattori - 1 1.1 Cos’`e un bioreattore Dispositivo che favorisce e stimola una reazione biologica. Per esserci una reazione biologica deve esserci un organismo vivente procariote/eucariote, ad esempio batterio, lievito, cellula o fungo. L’organismo fa la reazione mentre il bioreattore accellera e favorisce o promuove la reazione e senza il bioreat- tore tale reazione non avviene proprio. Il fermentatore della birra `e il primo bioreattore della storia (3300 A.C.), oggetto che controlla la T e permette di ottenere la birra a seguito di processo di fermentazione. 1.2 Ingegneria dei tessuti L’obiettivo `e quello di generare o riparare un tessuto/organo che ha perso le proprie funzionalit`a. Generare o riparare, quindi creiamo da zero o ricostru- iamo un ”pezzo” di un qualcosa che esiste gi`a. Pezzi possono essere un pezzo di un qualsiasi tessuto, osseo o muscolare ad esempio, oppure si pu`o creare da zero un intero organo composto da di↵erenti pezzi. Ci`o che si crea `e funzionale dal punto di vista biologica. 1.2.1 Storia dell’ingegneria dei tessuti Nasce negli anni ’80, mettere assieme dei tessuti, successivamente si `e iniziato a stimolare cellule e tessuti, nascono le iPS che aiutano a stimolare fino a pensare di poter ingegnerizzare organi interi. La popolazione invecchia, il che porta alla necessit`a di avere sostituiti di componenti biologici, ci`o si lega alla mancanza di donatori di organi. Un altro problema `e andare a risolvere patologie congenite, ovvero bambini che necessitano di organi app ena nati. Infine, p osso creare modelli in vitro su cui posso testare farmaci e terapie, andando a sostituire il modello animale secondo il modello RRR (reduce, refined, reused). 6 1.2.2 Recap ingegneria dei tessuti Prendo le cellule e lo sca↵old e li metto nel bioreattore al fine di ot- tenere tessuto/organo. Bisogna capire le specifiche di progetto del bioreat- tore. La scelta del bioreattore riprendono alcuni concetti dell’embriogenesi, la conoscenza di tale embriogenesi di un determinato organo `e necessario per sapere quale tipologia di stimolo il bioreattore deve esercitare sulle cellule per ingegnerizzare il tessuto. Le cellule staminali sono totipotenti (qualsiasi parte del corpo umano compreso le parti extra embrionali come la placenta), pluripotenti (qualsiasi tessuto del corpo umano, cellule embrioniche staminali, potenziale replicativo infinito), cellule staminali adulte specializzate (specializ- zate nel formare determinati tessuti). Il cervello non presenta cellule staminali. Ognuna di queste cellule, a seconda del livello a cui si trovano, cambiano le con- dizioni di cultura e di conseguenza anche le specifiche del bioreattore. Le cellule embrionali (ESCs) sono pluripotenti, hanno un elevato potere replicativo, non sono autologhe, ci sono problematiche etiche e sono presentano problemi di tu- morogenesi. Le cellule staminali adulte (SCs), invece, sono pi`u specializzate, hanno una potere replicativo limitato, pu`o essere autologa, non ci sono grossi problemi etici e tendenzialmente non sono tumorogeniche. Le SCs presentano alcuni problemi, si isolano poco, basso potenziale di di↵erenziazione, sono state esposte durante la loro vita ad agenti tossici o virus. Sono state sviluppate quindi le cellule staminali pluripotenti indotte per poter provare a far regredire le cellule staminali adulte in cellule staminali embrionali con capacit`a pluripo- tenti. Questo comporta rischi tumorogenici e quindi si cerca di ridurre questa regressione fermandola prima in modo da ridurre si il potere replicativo e di di↵erenziazione della cellula ma riducendo anche i rischi collaterali. 1.3 Come progettare un bioreattore Le cellule staminali pi`u sono embrionali pi`u sono delicate, avendo poco margine d’errore nel campo di progettazione del bioreattore. Le cellule adulte sono pi`u robuste. Posso aver bisogno di di↵erenziare cellule in maniera di↵erente oppure non di↵erenziarle e bloccare la di↵erenziazione. Poi, se utilizzo di↵erenti cellule 7 devo capire come queste interagiscono tra loro e di conseguenza anche tipo di terreno di cultura devo usare. Infine, devo capire a che tipo di stimoli devono essere soggette le cellule e questo cambia in base a tutti i fattori visti sopra. Uno degli approcci dell’ingegneria tissutale `e quello di utilizzare il corpo come bioreattore, essendo il corpo il miglior bioreattore. Non essendo bravi come il corpo, se ad esempio devo ingegnerizzare un osso, mi basta farlo specializzare al fine che sia un osso ancora in crescita e poi impiantarlo fino a totale rigenerazione nel corpo. 1.4 ECM e sca↵old Itessutisoncompostidacellulemaanchedamatriceextracellulare(ECM), che varia in base al tip o cellulare e al suo impiego finale nel corp o. ECM funge da supporto per le cellule, composto da proteine e fattori di crescita, che guidano le cellule che ci vivono all’interno. Il rapporto tra cellule e ECM varia in base ai distretti corporei e ci`o mi permette di capire se quando ingnegerizzo un tessuto mi bastano magari solo le cellule oppure devo avere anche ECM che aiutano le cellule a crescere correttamente. Spesso le patologie non attaccano le cellule ma la ECM che circonda le cellule, distruggendo o alterando le pro- priet`a meccaniche. Quindi lo sca↵old non `e solo un supporto, ma sostituisce temporaneamente la ECM in tutto, funge da guida per le cellule attraverso la micro/macro struttura e stimoli che trasferiscono alle cellule, ovvero stimoli biochimici. Infine, deve fornire le propriet`a biomeccaniche corrette, non per forza che simulino gli stimoli reali ma che gradualmente permetta alle cellule di raggiungere col tempo dopo impianto nel corpo tali stimoli. 1.4.1 Tipologie di sca↵old Gli sca↵old possono essere di tipo naturale, sintetico o misto. Il tipo di sca↵old scelto influenza la chimica, i tempi di degradazione e la tipologia di materiale degradato. 1.4.2 Progettazione dello sca↵old • Dimensione (grande, piccolo, umano o animale) e forma del tessuto che si vuole trattare (piatto, 3d) • Come sostengo il tessuto nel mio bioreattore • Quali proprit`a meccaniche devono essere usate • Quale tipo di macro e micro struttura deve avere in funzione delle cellule edelleproblematichechelosca↵oldstessopu`oavereinfunzionedelle altre necessit`a 8 1.5 Ruolo del bioreattore Il bioreattore `e il regista, ovvero fornisce e/o controlla un ambiente controllato acelluleesca↵old. Essomonitoratemperatura(T=37 °C), ossigeno ( O2¡= 20%), anidride carbonica ( CO 2), pH, pressione che sentono le cellule, apporto di nutrienti e rimozione dei cataboliti tossici. Devo fornire o monitorare uno stimolo che pu`o essere biologico, chimico o fisico. Non `e detto che il bioreattore debba fornire direttamente entrambi i controlli, dato che pu`o essere fatto da altri sistemi oppure li pu`o controllare in maniera indiretta tramite il controllo di sistemi di rilascio che e↵ettivamente fornisce lo stimolo. Infine un bioreattore DEVE fornire la sterilit`a del sistema cellule+sca↵old, non essendoci nessun tipo di sistema immunitario attorno al bioreattore. Questo ultimo punto `e l’aspetto pi`u complesso da mantenere. 1.5.1 Componenti del bioreattore Abbiamo lo sca↵old + cellule dentro ad una camera, contenuta nell’ambiente di cultura controllato. Abbiamo poi il sistema di attuazione che fa funzionare il bioreattore, sistema di controllo che monitora e un eventuale sistema di feedback. Esternamente abbiamo poi l’interfaccia. Camera Essa `e il cuore del bioreattore, all’interno abbiamo il costrutto. • Deve essere sterile, avere dimensioni adeguate • Deve avere qualcosa che regge il tessuto (non banale da progettare per non influenzare il costrutto), • Deve avere degli accessi (almeno un’apertura, di tipo idraulico e/o ottico) • Deve essere biocompatibile. Ambiente di cultura • Deve controllare almeno la temperatura (T) • Pu`o controllare la CO2 • Pu`o controllare l’ossigeno, che pu`o essere (ipossia, normopossia o iper- ossia) • Pu`o controllare il pH Sistema di attuazione Fornisce la condizione dinamica alla cultura. Tale stimolo dinamico pu`o essere di vario tipo, dinamico significa che tutti i parametri della cultura variano nel tempo. Il termine dinamico `e abbastanza generico. Deve poter fornire singoli oppure multipli stimoli. Lo stimolo deve essere correttamente dimensionato e scelto per raggiunger il range di stimolazione d’interesse 9 CELLULE SCAFFOLD NO CITOTOSSICITÀ Interfaccia utente Pu`o essere qualsiasi cosa, tutto ci`o che viene toccato da chi tratta il bioreat- tore. Non `e solo la parte elettronica, ma anche come lo prende in mano, il bioreattore o un suo componente, come fare a inserire oggetti nella camera, come mantenere la sterilit`a mentre si interagisce. Spesso l’utente finale pu`o essere un altro ingegnere, un biologo, un medico oppure qualcuno che lo deve vendere. Possibili stimoli • Stimolo muscolare attraverso trazione uni-assiale • Stimolo di perfusione tramite liquido • Va s o s a n g u i g n o c h e s t i m o l a l a c e l l u l a d i l a t a n d o s i e c o n t r a e n d o s i sistema di controllo e feedback E’ necessario sempre, complicato o meno. Permette di far funzionare tutte le parti elettriche che poi controllano a loro volta il sistema di attuazione. Il sistema di controllo deve essere pi `u o meno sensibile in base alla tipologie di cellule trattate, cellule embrionali necessitano di maggior controllo di cellule staminali adulte. In generale occorre mantenere semplicit`a, quindi non sovra stimare sistemi di controllo che possono portare amalfunzionamentiecostiinutili. Esempio pratico Ogni caratteristica delle cellule e dello sca↵old contribuisce a definire le speci- fiche di progettazione del bioreattore. 10 Chapter 2 Introduzione ai bioreattori - 2 2.1 Altri componenti dell’ingegenria dei tes- suti Oltre alle cellule e allo sca↵old (attore protagonista e non protagonista) e al bioreattore (regista), ci sono altri due componenti che compongono il quadro completo, ovvero l’utente finale (produttore ovvero chi mette i soldi) e gli enti regolatori che danno l’ok all’utilizzo di tale dispositivi (pubblico). La progettazione del bioreattore `e dettata dalle cellule e dall’impalcatura che si intende coltivare. Tale progettazione `e dettata anche dall’utente finali (target), ovvero ad esempio: • Istituti di ricerca o universit`a • Aziende che forniscono TE come prodotto • Aziende che producono TE RnD (ricerca e sviluppo) • Ambiente clinico 11 La progettazione del bioreattore `e regolamentata dalla legge, in particolare da: • Conformit`a elettrica • Norme sanitarie 2.2 Utenti finali 2.2.1 Quali sono gli obiettivi degli utenti target? Bioreattori per la ricerca TERM (Tissue Eng/Medicina Rigenera- tiva) Ibioreattorinellaricercasonoutilizzatiper far progredire le conoscenze nel campo dell’ingegneria tissutale ,siacreando nuovi concetti di TE (ad esempio, un nuovo organo, un nuovo tipo di cellula utilizzata per ingeg- nerizzare un tessuto, un tessuto ingegnerizzato con diversi tipi di cellule allo stesso tempo), sia dimostrando i meccanismi biologici coinvolti nella TE (ad esempio, dimostrando come un percorso cellulare migliori il risultato complessivo del processo di ingegneria). I bioreattori nella ricerca possono essere utilizzati anche per generare modelli complessi in vitro .Molti risultati ottenuti in modelli animali non possono essere tradotti in clinica, per cui negli ultimi anni `e nata l’esigenza di generare modelli umani (utilizzando cellule umane) adabili e complessi. I bioreattori nella ricerca possono essere utilizzati per fornire condizioni di coltura che in precedenza non er- ano realizzabili ,comelacolturadinamicadicostruttitridimensionali,siasu macroscala (organi) che su microscala (organoidi). Bioreattori per aziende TERM Le aziende sono generalmente interessate a tradurre i concetti della ricerca TERM in clinica .Sonointeressateacreareunprodottochepotrebbeessere il bioreattore stesso o il costrutto ingegnerizzato che viene generato. Alcune aziende investono anche nella ricerca, ma di solito si tratta di una ricerca pi`u applicata rispetto alla ricerca di base svolta dalle universit`a e dagli istituti di ricerca. Tuttavia, ricordiamo che un’azienda mira a creare un prodotto o un servizio e, in ultima analisi, un profitto . Bioreattori per applicazioni cliniche TERM Le applicazioni cliniche comportano una serie di rigide normative dettate dagli enti preposti alla tutela della salute (ad es. FDA, EMA, AIFA). Ci sono pochissimi esempi di bioreattori in clinica, nonostante 30 anni di in- gegneria tissutale. 12 I tempi normali per rendere un farmaco classico da una semplice idea al commercio sono di 12-15 o addirittura 20 anni. Per la TE non si parla di farmaco semplice, quindi 30 anni sono ancora troppo pochi per pensare di avere tante soluzioni mediche derivanti dalla TE. 2.2.2 Come funziona l’EMA? • In Europa, l’Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) valuta le richieste di autorizzazione all’immissione in commercio di un prodotto di TE • L’EMA controlla e supervisiona costantemente la sicurezza dei farmaci autorizzati nell’UE, per garantire che i benefici siano superiori ai rischi. 13 • Tuttavia, l’EMA non valuta la domanda iniziale di autorizzazione all’immissione in commercio di tutti i farmaci nell’UE. La maggior parte dei farmaci disponibili nell’UE `e autorizzata a livello nazionale. • Inoltre, l’EMA non valuta i dispositivi medici. I dispositivi medici sono regolamentati dalle autorit`a nazionali competenti in Europa. • Nel gennaio 2022 l’EMA ha promosso il Regolamento sulle sperimen- tazioni cliniche, che armonizza i processi di valutazione e supervisione delle sperimentazioni cliniche in tutta l’UE. • La valutazione, l’autorizzazione e la supervisione delle sperimentazioni cliniche sono di competenza degli Stati membri dell’UE e dei Paesi dello Spazio economico europeo (SEE). • Prima del regolamento, gli sponsor delle sperimentazioni cliniche dove- vano presentare separatamente le domande di sperimentazione clinica alle autorit`a nazionali competenti e ai comitati etici di ciascun Paese per ottenere l’approvazione regolamentare a condurre una sperimentazione clinica. Su 25 (ad aprile 2023) ATMP approvate dall’EMA : • 11 sono terapie genetiche • 6 sono terapie cellulari CAR-t • 5sonoterapiecellulari • Solo 3 sono prodotti di ingegneria tissutale ,chetuttaviasonoan- cora lontani dal concetto di un grande organo funzionale ingegnerizzato. – Due di queste sono praticamente terapie cellulari che sfruttano un bioreattore e sono due sostituti cartillaginei – Il terzo, sviluppato in Italia, permette di attuare terapie staminali alivellodellacornea 14 2.3 Bioreattore per applicazione aziendale / clinica Analizziamo il bioreattore • Presenta un ambiente controllato (thermostatic compartment) • Ha dei sensori di pH, monitora cosa accade all’interno del compartimento • Sistema di imaging integrato, dandomi un controllo totale • Controllo di gas • Interfaccia utente facile • Lettore di codice a barre per avere traccia di tutto il processo • Presenta sacche monouso sterili Il bioreattore `e conforme alle linee guida UE sulle Good Manufacturing Practice (GMP) o buone pratiche di fabbricazione specifiche per i medicinali per terapie avanzate. Di seguito alcuni contenuti rilevanti per il nostro caso di studio di un bioreattore secondo le GMP: • Misure per prevenire la contaminazione incrociata, tra cui: – Uso di ”sistemi chiusi” per la lavorazione e il trasferimento di ma- teriale/prodotto tra le apparecchiature – Utilizzo di tecnologie monouso monouso • Le connessioni che devono essere e↵ettuate in condizioni asettiche de- vono essere eseguite in un’area pulita critica di grado A con un’area pulita di fondo di grado B, a meno che la connessione non sia e↵ettuata mediante un sistema sterile convalidato. Quando i materiali vengono aggiunti/prelevati dal sistema chiuso senza una connessione asettica, il sistema non pu`o pi`u essere considerato chiuso 15 • Igasintrodottinelluogodilavoroasetticoocheentranoincontattocon il prodotto devono passare attraverso filtri sterilizzanti. • La presenza di contenitori e/o materiali suscettibili di generare particelle deve essere essere ridotta al minimo nelle aree pulite • L’uso di pi`u di un isolatore chiuso (o di altri sistemi chiusi) nello stesso locale `e accettabile, a condizione che vengano prese misure di mitigazione appropriate per evitare la contaminazione incrociata o la mescolanza dei materiali, compresa l’espulsione separata dell’aria esausta dagli isolatori. 2.3.1 Impatto di un bioreattore di questo tipo sulla pro- duzione 2.3.2 Un concetto importante: scale up/scale out Scaling Out Lo scaling out nei bioreattori comporta la creazione di un bioreattore (o di pi`u bioreattori) che pu`o essere scalato per fornire lo stesso processo a 16 PAZIENTI pi`u pazienti .Spesso`eunafasediprogettazionedeibioreattori Scaling Up Lo scaling up nei bioreattori comporta la creazione di una versione aggior- nata del bioreattore in grado di progettare un tessuto/organo pi`u grande rispetto alla versione precedente. 2.3.3 Caratteristiche dei bioreattori aziendali/clinici • Molto costoso da acquistare ma economico da produrre per poter gener- are utili.La scelta del materiale `e fondamentale per ridurre i costi • Richiede monitoraggio e controllo dall’inizio alla fine del processo • Standardizzazione e riproducibilit`a di tutte le procedure e di tutti i com- ponenti , minimizzando il pi`u possibile la manipolazione umana dei pro- cessi 17 ORGANI GRANDI • Tr a c c i a b i l i t `a d e l p r o c e s s o e c o n t r o l l o d i q u a l i t `a • Conformit`a alle normative • Scalabile o meno • Modulare • Camere indipendenti in scala ridotta • Materiali monouso • Facilit`a d’uso (anche in questo caso l’utente finale potrebbe avere una formazione limitata sui bioreattori) • Strumenti manuali ed esterni • Sicurezza • Bassi volumi (i reagenti e i terreni di coltura certificati sono molto costosi) • Automazione 2.4 Bioreattori per la ricerca Ibioreattorisviluppatiperlaricercasonodispositivinonstandalonema vanno all’interno di un incubatore oppure la camera del bioreattore `e collegata ad una bombola di aria con il 5% di CO2 cercando di essere un dispositivo simil stand alone. Le connessioni non sono monouso ma sterilizzate, per minimizzare icostialmassimo. 18 GMP Scaling out SCALING UP 2.4.1 Caratteristiche di un bioreattore per la ricerca • Economico, dato che spesso i fondi per la ricerca sono limitati • Progettati per essere spesso modificati per seguire lo sviluppo del pro- getto, crescendo assieme al progetto di ricerca • Lavorati con metodi di tipo prototipale come la CNC o la stampa 3D, pensati per la produzione su piccola scala e custome • Parti non monouso • Adatti a tecniche di sterilizzazione in laboratorio come autoclave (ciclo va p o r e s e c c o o u m i d o a 1 2 0 °C) o UV • Materiali costosi • Non autonomo (non-standalone) • Facile da manipolare essendo utilizzato dagli stessi realizzatori del biore- attore, devono quindi essere oggetti facili da manipolare e col quale fare esperimenti e magari variazioni anche strutturali • Monitoraggio assente o limitato dato che il campione potrebbe essere dis- truttivo quindi analizzato tagliandolo a fine trattamento con bioreattore • Nessuna certificazione (a meno che non li si venda ai ricercatori) In conclusione, l’impostazione del bioreattore (ricerca/azienda/clinica) e le normative in vigore dettano le specifiche di progettazione . 19 STERILIZZABILI Chapter 3 Bioreattori a perfusione 3.1 Perfusione non confinata La perfusione non confinata, come quella dei spinner flask bioreactors ,che `e u n o d e i p i `u a n t i c h i c o n c e t t i d i b i o r e a t t o r e p r o g e t t a t i . I l fl u i d o `e l i b e r o d i muoversi dove vuole. 3.2 Perfusione confinata Perfusione confinata, in cui il mezzo viene forzato attraverso lo sca↵old o lo sca↵old viene spostato attraverso il mezzo. Ci`o richiede un confinamento dello sca↵old e lo sca↵old stesso deve essere poroso, dovendo permettere al flusso di attraversarlo. Il controllo della porosit`a dello sca↵old permette quindi di controllare da parte di chi sviluppa lo sca↵old le di↵erenti propriet`a del flusso. 20 3.3 Come la perfusione influisce sulla semina La semina per perfusione consente una distribuzione uniforme in tutto lo sca↵old, ma presenta alcune insidie. Lo shear-stress deve essere delicato e le cellule devono essere intrappolate all’interno dello sca↵old. La perfusione migliora la distribuzione di ossigeno e nutrienti e rimuove i cataboliti. 3.4 Caratteristiche principali dei bioreattori a perfusione Le caratteristiche principali di un biorettaore a perfusione sono le seguenti: • Miglioramento dell’ossigenazione • Miglioramento del trasporto di massa (nutrienti/cataboliti) • Stress da taglio (shear stress) – Attiva la meccanotrasduzione: il citoscheletto cellulare, una volta sollecitato da stimoli esterni dovuti a shear stress comporta atti- vazione della meccanotrasduzione con consegunte razione da parte 21 della cellula stessa che reagisce in maniera di↵erente in base all’intenist`a dello shear stress – Promuove la produzione di ECM – Promuove la crescita o stopparla – Promuovere di↵erenziazione cellulare: una cellula staminale in base al tipo di stimolo esterno pu`o spingere verso un determinato fenotipo 3.5 Esempio di bioreattore a perfusione 3.5.1 Il bioreattore U-Cup Lo sca↵old del bioreattore `e tenuto all’interno di una camera monouso (costrutto) euntubochefungedareservoirchespingeetirailfluidoforzandolonello sca↵old (sca↵old fermo e terreno in movimento). I fluidi sono quindi forzati attraverso una perfusione confinata attraverso lo sca↵old. La camera `e monouso e il terreno `e spinto attarverso il costrutto. Progettato nel corso degli anni e ora un bioreattore commerciale di Cellec Biotek. 22 3.5.2 Il bioreattore OPB Bioreattore a perfusione oscillante (terreno fermo, sca↵old in movimento). Qui la gravit`a agisce come forza motrice. Noi abbiamo uno sca↵old in un tubo circolare bloccato e questo tubo viene fatto ruotare. In questo caso `e la gravit`a stessa il movimento dello sca↵old attraverso il terreno. Quindi lo sca↵old stesso viene mosso attraverso un terreno statico. 23 3.6 Approfondiamo il progetto di un bioreat- tore • Fa c i l i t `a d ’ u s o • Adabile • Economico: in base al tipo di utilizzo (ricerca o sviluppo aziendale) • Fu n z i o n a l e • Ergonomico (no ingombrante) • Biocompatibile • Adatto alla sterilizzazione (autoclave) • Non sfuso • Aree senza ristagno: sono zone in cui possono svilupparsi batteri • Tr a s p a r e n t e • Possibilit`a di scambiare il mezzo • Possibilit`a di imp ostare un proto collo a temp o variabile • Sterilit`a • Manuale d’uso 3.6.1 Requisiti specifici per un bioreattore a perfusione • Interfaccia tra bioreattore, pompa e sistema di controllo: se voglio movi- mentare il liquido posso farlo tramite una pompa (U-cup) oppure ruotando il bioreattore stesso (OPB) • Nessuna perdita sotto pressione: il livello di tenuta idraulica deve man- tenere una pressione elevata sviluppata dal pompaggio • Perfusione confinata e bidirezionale • Ve l o c i t `a d i p e r f u s i o n e 1 0 0 ¡ s ¡ 1 5 0 0 u m / s : d e t t a t e d a l l e s p e c i fi c h e b i o l o g i c h e del tessuto • Riempimento automatizzato e senza bolle • Ossigenazione del mezzo: se la struttura `e chiusa, il terreno posto nella camera non `e ossigenato perch´e isolato dall’esterno, per cui deve esserci un punto in cui il terreno viene ossigenato in maniera artificiale • Vo l u m e d i p r i m i n g m i n i m o : o v v e r o i l v o l u m e d i t e r r e n o i n g e n e r a l e p r e - sente in tutti i tubi del bioreattore, che deve essere minimizzato 24 • Interfaccia con sensori di pH e O2 • Sistema di controllo basato su PC • Linee di perfusione indipendenti diverse – Idrauliche: ogni linea deve poter essere controllata in maniera in- dipendente dal punto di vista idrodinamico – Biologiche: ogni linea del terreno non vede le altre linee per evitare contaminazione biologica (cross contaminazione) dei terreni • Alloggiamento di sca↵old con altezze diverse: la stessa camera deve poter alloggiare sca↵old di di↵erenti dimensioni, per farlo posso progettare pi`u camere in base ai singoli sca↵old oppure posso scegliere di sviluppare una camera che si adatti per un ampio range di misure 3.7 Schema a blocchi del bioreattore L’idea del circuito di un bioreattore a perfusione di avere una camera, una pompa, l’ossigenazione del terreno a monte e a valle della camera e una elet- trovalvola che controlla la pressione nello sca↵old 3.7.1 Camera di coltura La camera `e composta da due pezzi che si vanno a chiudere ad incastro con guarnizione (o-ring) e lo sca↵old viene poi alloggiato in un cilindro che lo contiene e forma la camera. • Dimensioni dello sca↵old d=10mm, h=4mm • Area perfusa d=8mm Il materiale della camera scelto `e il policarbonato, avendo le seguenti propriet`a: • Tr a s p a r e n t e 25 • Autoclavabile (per un numero finito di cicli) • Biocompatibile • Stabilit`a dimensionale Motivazione del design della camera • Fa c i l i t `a d ’ u s o e d i a l l o g g i a m e n t o d e l l o s c a↵o l d • Mantiene la sterilit`a • Progettata per consentire un corretto riempimento e perfusione dello sca↵old • Nessun ristagno di terreno o per lo mento ridotte al minimo (ci sono punti negli angoli della camera in cui si possono formare zone di ristagno) • Progettata per la conformit`a alle GMP (good manifacturing practicise) 3.7.2 Sistema di ossigenazione L’ossigenazione viene erogata attraverso tubi permeabili all’O2. Il terreno viene quindi fatto passare in questi tubi il cui materiale utilizzato `e il sili- cone platinato . Dopo i calcoli (che verranno descritti in dettaglio in un’altra lezione) che tengono conto di pO2, di↵usione dell’ossigeno e stress di taglio, il materiale scelto `e il silicone platinato. Di norma si ottengono questi risultati per avere una corretta perfuzione del nostro ”ossigenatore”: • Lunghezza del tubo = 3,6 m • Di = 0,79 mm • De = 2,38 mm 26 L’obiettivo di Progettato `e quello di ridurre al minimo l’ingombro me- diante l’avvolgimento dei tubi ,abbassarequindialmassimoilvolume di priming. Per farlo viene progettata una sorta di bobina attorno al quale avvolgere il tub o p er ridurre l’ingombro, ottenendo un pacchetto facilmente spostabile di tubo ossigenatore. Scelta dei tubi La variazione tra Di e De del tubo varia la compliance del tubo. La vari- azione dello spessore di parete permette di alterare quella che `e la perfusione dell’ossigeno, aumentando la permeabilit`a quando lo spessore diminuisce. Ven- gono dati in base al materiale del tubo tutti i dati di coeciente di perme- abilit`a a CO2 e O2. Viene anche data la permeabilit`a dell’azoto, che pompato nell’incubatore permette di simulare ipossia nel circuito, abbsando la concen- trazione di O2 3.7.3 Pompa La pompa usata `e una pompa di tipo roller, ovvero in cui il tubo viene fatto passare in rulli che girando generano una peristalsi che permette al fluido di essere spinto nel tubo. Queste pompe permettono di mantenere stabilit`a non toccando ci`o che fluisce nel tubo ma solo l’esterno del tubo. Possono avere di↵erente numero di rulli, l’andamento del flusso nel tempo rimane pressoch´e costante con un numero elevato di tubi, ma ci`o influisce sul costo della pompa, che aumenta all’aumentare dei rulli. Posso monatere fino a 4 rulli indip endenti, ma l’indipendenza idraulica non vine del tutto mantenuta perch´e comunque 27 mammaSTERILITA sono soggetti agli stessi rulli. Solo nel caso in cui vi sono rulli diversi per tubi diversi abbiamo indipendenza idraulica. 3.7.4 Sensoristica La sensoristica scelta `e di tipo non invasivo. I sensori invasivi ono uelli che vengono in contatto con i sistemi di cultura (altera la sterilit`a). Nel caso di non invasivit`a invece non altera la sterilit`a come ad esempio attraverso sensori ottici che osservano la variazione di colore di patch polimerimerici fotosensibili che cambiano colore in base al variare del pH. L’intervallo di pH misurato `e tra pH=5,5 e pH=8. Tale sensoristica pu`o essere utilizzata anche per il monitoraggio dell’O2, utilizzando lo stesso concetto. 28 3.7.5 Come viene progettata la linea di perfusione Nel mezzo viene posta la camera, a sinistra vi `e la camera di reservoir che riduce il priming volume, il tubo che va nel sottopompa `e fatto di materiale di↵erente, molto pi`u resistente e di diametro maggiore con minor permeabilit`a. Le linee sono idraulicamente indipendenti (fino a un certo punto) e biologica- mente indipendenti. Il mezzo viene scambiato tramite connettori sterili. Le dimensioni sono ridotte 375x125x150mm e anche il priming volume `e minimo, pari a 2ml, in modo che quanto cambio il terreno di culu`ıtura, il richio di non cambiare parte del terreno `e bassa, riuscendo cos`ı a cambiare tutto il terreno in modo da introdurre nel bioreattore sempre terreno nuovo. 3.7.6 Specifiche del sistema di controllo Specifiche generali (quelle che ogni sistema dovrebbe avere) • Fa c i l e d a u s a r e , a u t o e s p l i c a t i v o • Sicurezza elettrica • Adabilit`a • Economico • Fu n z i o n a l e • Manuale d’uso dettagliato Specifiche particolari (dettate da questa applicazione specifica) • Sistema di perfusione • Interfaccia pompa/EV/sensori • Basato su PC • Schemi variabili nel tempo (s/min/h) • Fu n z i o n e d i p a u s a e r e s e t • Riempimento automatico del circuito • Monitoraggio in tempo reale 29 • Alloggiamento, cavi e connettori protetti dall’ambiente dell’incubatore 3.7.7 Software Il software presenta tre di↵erenti sezioni d’interfaccia con l’utente per gestire il bioreattore: 1. Impostazione dei parametri 2. Pannello di controllo 3. Controllo e monitoraggio della perfusione 30 3.7.8 Bioreattore assemblato 3.8 Manuale d’uso per l’utente Nel manuale d’uso devono essere descritti tutti i componenti che son stati utilizzati in modo che l’utilizzatore finale non debba rivolgersi al produttore per poter usare il bioreattore 3.9 Validazione di un bioreattore Il bioreattore deve essere valutato dal punti di vista ingegneristico (nessuna perdita e resistenza idraulica e meccanica coerente con le aspettative) e dal 31 punto di vista biologico/cellulare (le cellule sopravvivono e crescono corretta- mente) 3.9.1 Validazione ingegneristica Valutazione del riempimento senza bolle • Resistenza idraulica minima • Perfusione uniforme delle 3 linee • Debbling durante il riempimento • Riempimento corretto della camera di coltura Valutazione della sterilizzazione in autoclave • Utilizzo di marcatori di ”prova della sterilizzazione”. Stabilit`a dimensionale • Stabilit`a dimensionale dei pezzi dopo 10 cicli di autoclave • Resistenza idraulica dopo 10 cicli di autoclave Sterilit`a • Diversi cicli di perfusione con terreno di coltura • Sostituzione del terreno di coltura • PCR per valutare le contaminazioni Funzionamento corretto del sistema di controllo • Fu n z i o n a m e n t o d e l l e E V • Attuazione corretta dei protocolli in funzione del tempo 3.9.2 Validazione cellulare Prima validazione cellulare • Tipo cellulare: SAOS-2 (linea cellulare di osteosarcoma), 1 milione di cellule • Sca↵old: Idrossiapatite (Engipore ® ), d=10mm, h=4mm • Porosit`a: 8,5%/volume • Te r r e n o : M c C o y 5 A c o n f a t t o r i o s t e o g e n i c i – beta-glicerofosfato 32 – Desametasone • Protocollo: – 11 giorni – Velocit`a 100um/sec (pari a un FR=0,3ml/min) – Inversione della velocit`a di flusso ogni 48h La cultura dinamica migliora solo in parte la crescita cellulare ma usando una linea cellulare di tipo tumorale questa di↵erenza non `e cos`ı sostanziosa. Il pH cresce col tempo dato che l’ambiente diventa alcalino. Dal punto di vista della disposizione cellulare sullo sca↵old, le cellule sono meglio organizzate nel caso della cultura dinamica. Osservando dopo trattamento di immunofluo- resecnza notiamo che segnando Alcaline Phosphatase e collagene I, nel caso della cultura dinamica vediamo come a pari numero di cellule abbiamo un mag- gior di↵erenziamento verso gli osteoblatsi, grazie a stimolazione meccanica di shear stress fornito tramite bioreattore dinamico. Seconda validazione cellulare • Tipologia cellulare: hMSC (cellule staminali mesenchimali) 1 milione di cellule • Sca↵old: Idrossiapatite (Engipore ® ), d=10mm, h=4mm 33 O • Porosit`a=80%/volume • Te r r e n o : M c C o y 5 A c o n f a t t o r i o s t e o g e n i c i – Beta-glicerofosfato – Desametasone – Ascorbicacido • Protocollo – 21 giorni – Velocit`a 100um/sec (pari a FR=0,3ml/min) – Flusso unidirezionale Questa volta, usando cellule non tumorali ma cellule mesenchimali stami- nali, avendo di↵usione di ossigeno, stress controllato, rimozione di cataboliti e quindi un terreno di tipo dinamico ha fatto si di avere un maggior numero di cellule e una produzione di fosfatasi alcalina molto maggiore, che segna un maggior di↵erenziamento cellulare. Alivellodianalisiimmunofluorescente,vediamocomeilcitoscheletrosisia di↵erenziato maggiormente in osteblasta in perfusione dinamica, avendo un maggior numero di ostoblasti totalmente di↵erenziati, con conseguente pro- duzione di osteoclacina (rappresentata in verde). Inoltre, vediamo un’organizzazione migliorata nel caso dinamico a livello del citoscheletro cellulare. Il pH rimane costante a 7,5 che `e quello desiderato. Il monitoraggio del pH serve per com- prendere se le cellule stanno progredendo correttamente e in base ogni quanto il pH si alza (ovvero vengono rilasciati cataboliti che segnalano che la cultura sta avanzando a livello di di↵erenziamento) posso capire a che velocit`a le cellule avanzano nella di↵erenziazione. 34 3.10 Pro e Contro dei bioreattori a perfusione 3.10.1 Pro dei bioreattori a perfusione • Modulare: permette di coltivare molti sca↵old in parallelo • Linee bio indipendenti: nessuna contaminazione incrociata (cross con- taminazione) • Camere trasparenti: ispezione visiva • Sensori: monitoraggio in tempo reale • Linee idrauliche indipendenti: possono fermarsi in momenti diversi 3.10.2 Contro dei bioreattori a perfusione • Pompa ”emolitica”: la p ompa a rulli pu`o danneggiare le cellule, romp en- dole a causa dello schiacciamento generato dai rulli sulle cellule. La cel- lula morta rilascia sostanze che portano ad apoptosi delle cellule vicine. Non pu`o essere quindi utilizzata per la semina • L’assemblaggio non `e cos`ı semplice • Non sono minaturizzati 35 Chapter 4 Controllo di un bioreattore 4.1 Summary Come progettiamo il sistema di controllo di un bioreattore? Lo scopo della lezione `e fornire strumenti ed esempi per fornire il preliminare progettazione di un controllo del bioreattore • Approccio black blox • Schede tecniche dei componenti • Controllo di potenza • Logica • Ingressi • Come avvicinarsi a uController Coding 4.2 Esempio di lavoro Prendiamo per esempio un bioreattore per la cartilagine con due circuirti. In giallo prende il terreno dalla camera e poi lo fa passare in una bobina che lo mantiene in temperatura (perfusione). Un secondo circuito invece funge da ricambio del terreno di cultura, rappresentato in rosa (scambio del medium automatico). Quindi l’intero sistema `e composto da: • Reservoir • Boccetta di waste (terreno rimosso e buttato) • Elettrovalvola pinzatubo che non altera la sterilit`a • Pompa p eristaltica che p ermette lo scambio del terreno di coltura • Pompa p eristaltica p er la p erfusione semplice del terreno di coltura • Scambiatore di calore per mantenere la temperatra del terreno 36 4.3 Approccio a black box Una scatola nera (scatola nera) `e un sistema che pu`o essere visto in termini di input e output. In questo caso specifico sono interessato a controllare le portate del terreno di coltura (flow rate), le tempistiche di protocollo, i volumi di fluido e le temperature della coltura. Man mano che procedo devo cercare di dettagliare i singoli pezzi del black box, a ritroso dagli output cerco di descriverli nel dettaglio. Dal bioreattore escono dei flussi e delle variazioni di temperatura. Tali variazioni derivano dai giri al minuto (rpm) delle pompe roller peristaltiche, la portata dipende dal diametro del tubo del sotto pompa e dai giri al minuto della pompa. Ci`o che posso controllare tramite il sistema di controllo per mediare il flusso sono solo i giri al minuto della pompa. L’elettrovalvola viene controllata somministrando o togliendo corrente per poterla aprire o chiudere in base alle esigenze. Il sistema di riscaldamento posso accenderlo o spegnerlo. Una variabile esterna `e invece la dimensione del tubo, ovvero una variabile che dipende da fattori costruttivi o dimensionali che non posso controllare tramite sistemi di controllo ma dii cui devo tener comunque conto durante l’intera fase di progettazione e sviluppo del bioreattore, compresa la fase di controllo. I giri al minuto come output si traducono alla potenza di corrente (voltaggio) che giunge alle elettrovalvole e pompe. 37 4.4 Definizione degli output 4.4.1 Pompa peristaltica Ora quindi devo ricercare la scheda tecnica dei dispositivi che intendo utiliz- zare. Ad esempio abbiamo una pompa peristaltica che presenta un motore che la fa girare, tale motore pu`o essere un motore DC, ovvero in corrente continua e che varia la sua velocit`a in base alla quantit`a di corrente fornita. A livello di sistema di controllo sono interessato al voltaggio di funzionamento (16-24 V), alla quantit`a di corrente consumata (  400-600 mA), al motor speed ovvero giri al minuto (rpm), al carico idraulico della pompa, alla direzione di rotazione del motore (senso orario), la temperatura massima che raggiunge, se vi `e la presenza di sistemi di controllo inclusi e per quante ore `e garantito (5.000 ore). Altro fattore d’interesse sono i grafici che mettono in relazione voltaggio (x) erpm(y). Ilfattoreimportantedatenereamente`echeadaltetensioni le pompe funzionano molto bene mentre a basse tensioni fanno pi`u fatica a funzionare correttamente. 4.4.2 Elettrovalvole pinza tubo L’elettrovalvola pu`o essere a singola via o come nell’immagine a pi`u vie. All’interno del solenoide c’`e un magnete che in base alla variazione del campo fa scattare la chiusura o apertura della valvola. Queste valvole vanno bene per tubi in silicone ma che abbiano una durezza fino a 50 shore A. Il tubo `e l’unica cosa in contatto col fluido quindi la valvola non tocca il fluido non alterando la sterilit`a. La valvola in se ha una serie di propriet`a dettagliate, si chiude e resta chiusa, 38 il materiale del casing, la max temperatura di funzionamento, standard che hanno i connettori elettrici, il grado di protezione e i voltaggi entro cui fun- ziona la valvola. Altro dato `e l’assorbimento in potenza, importante perch`e se non garantisco quella potenza la valvola non rimane totalmente chiusa durante il pinzaggio del tubo. Per far scattare la chiusura di una valvola necessito di una corrente maggiore rispetto al mantenimento di chiusura, tale fattore pu`o essere valutato in fase di progettazione di sistema di controllo. Le valvole hanno un tempo di apertura/chiusura, ovvero le valvole spente possono essere sempre aperte o sempre chiuse e viceversa quando forniamo corrente essa si chiude o si apre, in opposizione allo stato di riposo, tale tempo ha un massimo oltre il quale si surriscalda e si usura e torna alla sua posizione di origine. Quindi se necessito di una valvola quasi sempre chiusa scelgo una valvola che senza corrente resta chiusa e quella volta che la devo aprire somministro corrente. 4.4.3 Tapetino riscaldato Esso consiste in una resistenza che per e↵etto della corrente si scalda (come lunotto posteriore macchina). Siamo interessati al voltaggio per alimentare la resistenza (12V), il vattaggio in output (15 W); quindi assorbe un’elevata quantit`a di corrente essendo sopra a 1A. 39 4.4.4 Modulazione di larghezza di impulso (pulse Width modulation) E’ molto complesso controllare la corrente, di norma si controlla la tensione edalisitraduceincorrente. Quindici`ochevieneimposto`eilvoltaggio. Se abbiamo una tensione continua pari a 12V che restituisce una potenza pari all’integrale nel tempo dell’area sottesa. Nel caso avessimo un ON pari al 50% sar`a come utilizzare un 6V, con un 75% sarann`o come 9V e 25% come 3V. A frequenze elevate ci`o che verr`a letto dallo strumento quindi sar`a una tensione a 12V se sempre On e in base al PWM scelto (25, 50, 75 %), senza cambiare la tensione lo strumento legger`a una tensione simil-continua pari a 3, 6, 9 V. Limito in questo modo la dispersione e il tempo di alimentazione in corrente che scalderebb e estremamente l’oggetto, cos`ı invece alterno riscaldamento/raf- freddamento. 4.5 Controllo della potenza I valori di potenza che devo dare sono il PWM e la direzione (polarit`a pompa DC) della prima pompa, un secondo PWM e direzione alla pompa di ricircolo e un segnale di ON/OFF a valvola e tappetino riscaldante. La modalit`a per assegnare il corretto PWM e segnale di direzione sono i ponti-H , che sono in grado di controllare il motore. Occorre sapere il voltaggio (12 V) e la potenza massima (corrente massima) che il circuito composto da 40 TENSIONE CONTINUA A 12 MODULATA TRAMITE PWM AL 25,50175 ponte-H pu`o erogare. Molto spesso occorre aggiungere un dissipatore di calore per dissipare l’enorme calore sviluppato dal ponte-H durante il funzionamento. Se dobbiamo invece solo fornire un segnale di ON/OFF possiamo utilizzare un semplice rel`e, ovvero un oggetto composto da un solenoide che, se sottoposto a corrette, apre/chiude un secondo circuito. Del rel`e conosciamo il voltaggio (V) a cui opera e quanta corrente serve per farlo scattare. 41 Quindi utilizziamo un Motor Shield (ponte-H) per controllare PWM e di- rezione delle pompe 1 e 2 ed un rel`e per l’ON/OFF di valvola e tappetino riscaldante. Abbiamo quindi bisogno di un alimenattore che alimenti tutte queste funzionalit`a. Le due pompe assorbono al massimo 600mA con corrente di peak che possono arrivare a 3 volte tanto, la valvola assorbe 750mA mentre il tappetino 1,25A; per un totale di 3.2A se funziona tutto contemporanea- mente. Per quanto riguarda il margine di sicurezza, i possibili picchi e cos`ı via, `e m e g l i o o p t a r e p e r u n a sorgente da 5A con fusibili ,chepossaassorbirele va i r e c o r r e nt i d i p i c c o ch e p o t r e b b e r o d a n n e g g i a r e c i `o ch e s i t o r va a va l l e . 4.5.1 Logica vs Potenza All’interno del nostro sistema abbiamo due circuiti di↵erenti, un circuito di logica e uno di potenza, che si trovano a lavorare assieme in qualsiasi sistema alimentato ma svolgendo funzionalit`a di↵erenti. I due circuiti possono essere messi a cascata, prima quello logico e poi, se il logico non `e in grado di lavorare atensioniecorrentielevatisubentrailcircuitodipotenza. Circuito di logica Un circuito di logica si occupa ad esempio dell’interfaccia utente, svolge fun- zioni che richiedono bassa corrente e potenza • Bassa tensione (solitamente 3,3 V o 5 V) • Basse correnti (ordine dei mA) • Frequenze elevate (fino a MHz o GHz) • Protetto (se tocco un cirucito di logica si pu`o rompere lui senza farmi danno) Circuito di potenza Il circuito di potenza invece serve a svolgere il grosso del lavoro, con carichi e potenze elevati • Fino a tensioni elevate (380V) • Correnti elevate in alternata (A) • Frequenze medie • Da cui proteggersi (se tocco un circuito di potenza ci resto secco!) 4.5.2 Cablaggio e custodia Il sistema IP `e diviso da due gradi, il primo grado segnala l’ingresso di fattori solidi (IP 6 significa che non sono permessi ingressi di polveri), mentre ilsecondo grado segnala la protezione dall’ ingresso di fattori liquidi (IP 65 protezione da polveri e schizzi d’acqua). 42 4.6 Unit`a centrale Occorre ora aggiungere un’unit`a di controllo. Ci sono diverse opzioni per il nucleo (unit`a) di controllo, dalle pi `u semplici alle pi `u complesse. • L’approccio pi`u semplice potrebbe essere un circuito RC analogico , costo praticamente nullo (centesimi di euro), adabilit`a massima a meno di errori di progettazione, funzionalit`a minima. • Step successivo sono i circuiti integrati ,componentistichechesvolge serie di funzioni, ad esempio svolge funzione di un contatore, costo basso, adabilit`a non assoluta (possibilit`a remota di errori) e funzionalit`a gi`a pi`u elevata del semplice RC • Creazione di un circuito con microcontrollore (esempio Arduino ), ovvero risolve dei piccoli problemi attraverso un co dice che viene cari- cato nel sistema microcontrollore, espandendo al massimo le funzionalit`a. Presenta ingressi USB per poter accedere e aggiungere codice. Il costo `e sulla decina di euro, funzionalit`a elevata e adabilit`a che si abbassa maggiormente. Ovviamente si parla di componente di prototipazione • Successivamente abbiamo la single-board computer (Raspberry ), ovvero computer su scheda che a di↵erenza di Arduino ha la presenza di un sistema operativo vero e proprio che fa funzionare e gestisce il sistema. Esempio di single-board computer `e il telefonino. Funzion- alit`a ancora pi`u espanse e allo stesso tempo adabilit`a ridotta di molto dato che si sta parlando di un sistema operativo che pu`o ad esempio aggiornarsi o impallarsi. Anche il costo `e sicuramente molto pi`u elevato degli altri sistemi • Ultima possibilit`a `e quella di utilizzare un vero e proprio PC La scelta finale dell’unit`a centrale va quasi sempre verso un microcontrollore che presenta tutte le funzionalit`a p er p oter controllare tutto di un bioreattore, oltre `e un plus. Scegliamo quindi un Arduino Uno che controlla il tutto. 43 ↵ CONTROLLER 4.6.1 Arduino Arduino Uno `e una scheda microcontrollore basata su ATmega328P (scheda tecnica). Dispone di 14 pin di ingresso/uscita digitali (di cui 6 possono essere utilizzati come uscite PWM), 6 ingressi analogici, un risonatore ceramico da 16 MHz (CSTCE16M0V53-R0), una connessione USB, una presa di alimen- tazione, un header ICSP e un pulsante di reset. Il voltaggio operativo `e di 5V, il voltaggio di Input `e da 7 a 12 V (alimento a 12V e poi abbasso fino a 7V), presenta 14 pin di input/output, di cui 6 sono in grado di fornire segnali PWN (ne bastano 2 nel nostro caso) e 6 sono in grado di gestire segnali analogici di input, poi devo convertire il segnale da analogico a digitale tramite un DC, le correnti massime erogabili dai pin (20 mA), quanto `e la memoria flash (32 KB di cui 0,5 KB utilizzati dal bootloader, suciente per un bioreattore). 4.7 Definizione degli input Come posso interfacciarmi al microcontrollore, posso utilizzare uno schermo LCD per dare un feedback visivo all’utente, oppure una pulsantiera che pu`o essere touchscreen o analogica e dei semplici bottoni. In base all’utente finale che user`a il pro dotto verr`a quindi scelto la tip ologia di input, p er scegliere p osso anche chiedere direttamente all’utente finale cosa preferisce come interfaccia utente. 44 Le caratteristiche importanti che un sistema di input deve avere sono: • Fa c i l i t `a d i l e t t u r a • Fa c i l i t `a n e l l a c o m p r e n s i o n e d e l s i s t e m a • Utilizzo di simboli • Presenza di una legenda • Presenza di uno schermo • Dove viene utilizzato il sistema di input? • Specificare se si pu`o usare coi guanti di ogni tipo • Utilizzo di Wi-Fi/Bluetooth per usare smartphone per il controllo/mon- itoraggio • Stesse considerazioni su prezzo/funzione/adabilit`a 4.8 Manuale d’uso Caratteristiche importanti che devono essere presenti sul manuale d’uso: • Fa c i l e d a l e g g e r e • Fa c i l e d a c a p i r e • Cifre! • La sicurezza prima di tutto (requisito legale) • Sezione TLDR all’inizio • Sezione esaustiva al centro • Risoluzione dei problemi alla fine 45 RIASSUNTO Osservazioni • Il vostro background `e diverso rispetto a quello dell’utente finale • Avete progettato