Biomedical Engineering - Applicazioni Biotecnologiche e Bioreattori

1 - Bioreattori

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1 LEZIONE 1 INTRODUZIONE A I BIOREATTORI Un bioreattore è un dispositivo che promuove, favorisce o stimola una reazione biologica . Affinchè una reazione biologica possa avvenire, deve esserci un organismo vivente procariote o eucariote che può quindi essere un batterio, un lievito, una cellula, una cellula animale o un fungo. Quindi, la reazione biologica avviene ad opera di un organismo biologico ma il bioreattore è fondamentale i n quan to crea le condizioni che acceler ano e favoris cano tale reazione . Esistono molti bioreattori, ad esempio il primo bioreattore è stato il primo fermentatore della birra che risale al 3300 A.C , questo bioreattore fa sì che i lieviti all’interno dell’a cqua trasformino il malto in birra. Esistono poi bioreattori per la chimica, per le reazioni industriali , per le fermentazioni, basti pensare che anche il contenitore dell’umido è un bioreattore in quanto al suo interno i batteri fa nn o una fermentazione e il sacchetto chiuso e t enuto al caldo crea la condizione per far avvenire la reazione biologica. In particolare, in questo c orso ci concentr ere mo sui bioreattori per l’ingegneria dei tessuti. L’obiettivo dell’ ingegneria dei tessuti è generare o riparare un tessuto o un organo che ha perso la propria funzione. Con il termine g enerare si intende il fatto che si sta creando un tessuto o un organo da nuovo mentre con il termine riparare si intende ricostruire una sola parte di un tessuto o di un organo. Esistono quindi bioreattori per tessuti del corpo umano quali tessuto oss eo, tessuto adiposo, vaso sanguigno e bioreattori per organ i quali cuore, polmone, fegato . Negli ultimi anni la definizione di organo si è evoluta tanto che oggi gio rno la pelle è considerata un organo e non un semplice tessuto in quanto un organo è un sincizio di divers e cellule che esprimono diverse funzioni che portano a un particolare tipo di funzione . In particolare, l’ingegneria dei tessuti è nata negli anni ’80-’90 con Langer e Vacanti , due ingegneri che sono considerati i padri dell’ingegneria dei tessuti. Esistono diverse definizioni di ingegneria dei tessuti, un aspetto interessante riportato da una definizione diversa da quella vista in precedenza è che l’ingegneria dei tessuti è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze della vita verso lo sviluppo di sostituti biologici. È interessante l’ interdisciplinità perché l’ingegneria dei tessuti e la progettazione di bioreatt ori è un campo fortemente interdisciplinare dove sono richieste c onoscenze ingegneristiche quali conoscenze di fluidodinamica, elettronica e meccanica per poter progettare un bioreattore ma è necessario anche essere competenti nel campo delle scienze della vita e quindi avere conoscenze di biologia e medicina . Un concetto importante dell’ingegneria dei tessuti è che crea qualcosa di funzionale, infatti, l’ingegneria dei tessuti si distingue dalla protesica proprio per il fatto che permette di creare qualco sa di funzionale dal punto di vista biologico ovvero un tessuto biologico . Nella seguente figura è mostrata la s toria dell’ingegneria dei tessuti fino al 2020: 2 I primi studi nel campo dell’ingegneria dei tessuti risalgono ai primi anni ’80 quando si è iniziato a pensare al fatto di mettere insieme cellule e biomateriali . Si è arrivati poi a pensare di stimolare i tessuti, successivamente nel 2006 sono state inventate le iPS (cellule staminali a pluripotenza indotta) , s ono sta te poi introdotte tecnologie ingegneristiche come il 3D bioprinting e si pensa addirittura nel tempo di poter ingegnerizzare organi interi. Capiamo l’importanza e la necessità dell’ingegneria dei tessuti osservando i seguenti grafici che mettono in luce il fenomeno dell’invecchiamento della popolazione che comporta la necessità sempre più crescente di sostituti biologici funzionali. Il grafico a sinistra mostra come la popolazione sta invecchiando sempre di più nel tempo, soprattutto la percentuale di popolazione over 60 . Un altro grave problema è la mancanza di donatori riportata nel grafico a destra dove la curva rossa rappresenta il numero di persone in attesa di un trapianto mentre la curva verde rappresenta il numero di trapianti , n otiamo la presenta di un notevole gap che va sempre più aumentando . Per questi motivi si ha la necessità e il bisogno di ingegnerizzare organi e tessuti. Un altro problema è rappresentato dalle p atologie congenite , ancora oggi giorno molti bambini nascono con patologie e avrebbero bisogno di un sostituto . Inoltre, un altro vantaggio di utilizzare tessuti ingegnerizzati è la possibilità di creare modelli in vitro che possono poi essere utilizzati per lo studio di farmaci o per lo studio dello sviluppo del l’organo senza l’utilizzo di animali. Infatti, in ricerca sempre più si sta cercando di perseguire la regol a delle tre R (r eplacement, reduce , refine ) ovvero si cerca no in primo luogo alternative ai modelli animali , si cerca di costruire lo studio in modo da ridurre al minimo il numero di animali o migliorare il modello . Ad esempio, lo scorso anno l’FDA ha deciso che è possibile somministrare farmaci a persone anche se questi farmaci non sono stati testati su animali ma sul costrutto ingegnerizzato realizzato con bioreattore. Il principio fondamental e su cui si basa l’ingegneria dei tessuti è il seguente: le cellule vengono estratte da tessuti e seminate su uno scaffold, in seguito il tutto viene collocato all’interno di un bioreattore. Al termine di questo processo si ottiene u n tessuto ingegnerizzato o un organo . 3 Cerchiamo ora di capire in che modo le cellule e lo scaffold influenzino il design del bioreattore , questo concetto è molto importante perché il bi oreattore viene progettato in funzione del tipo di cellule e del tipo di scaffold che vengono inseriti nel bioreattore stesso. Prima di analizzare le specifiche di progetto del bioreattore, è però importante ricordare il processo di sviluppo umano ovvero l’embriogenesi e lo sviluppo del feto e questo perché nel momento in cui vogliamo ricostruire o generare un pezzo di tessuto o un organo è fondamentale mimare quello che succede in vivo. Ad esempio, il cuore si sviluppa a partire da un tubo che poi si ripi ega su sé stesso e si divide in quattro parti, capiamo dunque che gli stimoli che daremo a cellule che pensano di essere in un tubo sono molto diversi dagli stimoli che daremo a cellule presenti in un cuore già formato. Le cellule staminali si distin guono in: totipotenti , multipotenti, pluripotenti o cellule specializzate. Le cellule toti potenti sono in grado di creare qualsiasi tessuto del corpo compresi i tessuti extra -embrionali quali placenta, sacco vi tellino e fluido amniotico . L e cellule pluripotenti c ostitui scono la parte interna della blastociste e possono formare qualsiasi tessuto del corpo , tipicamente sono le cellule estratte da embrioni ovvero cellule staminali embrionali che possono dar origine a qualsiasi tipo di cellula e hanno un potenziale replicativo indefinito . D urante l’embriogenesi la blastociste si divide nei tre fogliet ti embrionali (mesoderma, ectoderma ed endoderma) che danno origine poi a tutti i tessuti del corpo. Nell’individuo adulto troviamo cellule multipotenti ovvero cellule staminali adulte e cellule specializzate. 4 A seconda della tipologia di cellula cambiano notevolmente le condizioni di coltura e quindi cambiano di conseguenza le specifiche del bioreattore. Per questo motivo quando progettiamo un bioreattore non bisogna solo avere a mente il tipo di tessuto da rig enerare ma anche le cellule che vengono utilizzate. Le cellule embrionali sono cellule pluripotenti, altamente proliferative ma non sono autologhe, ovvero dello specifico paziente , perché un individuo adulto non possiede cellule embrionali tanto che esis tono alcune linee embrionali create per ricerca non autologhe . Inoltre, le cellule embrionali presentano una serie di problemi etici e hanno problemi di tumorigenicità . Ricordiamo che una cellula tumorale è una cellula che si replica in modo incontrollato e con un alto potenziale replicativo . Invece, le cellule adulte sono cellule multipotenti più specializzate e hanno capacità proliferativa limitata, però hanno il vantaggio di poter essere cellule autolog he , non hanno problemi etici in quanto non vengono manipola ti embrioni e tendenzialmente non sono cellule tumorigeniche. Vediamo ora un esempio : in questo trial clinico sono state utilizzate cellule embrionali per la degenerazione della macula , una parte della cornea . Quindi, la macula è stata ingegnerizz ata e si sono potute utilizzare cellule embrionali perché nell’occhio non si verifica no reazioni immunitarie, infatti, esistono delle zone nel corpo dove le cellule del sistema immunitario non attaccano le cellule impiantate. Le cellule adulte sono largamente utilizzate, ad esempio in uno studio è stato fatto un primo tentativo funzionale di utilizzo di cellule staminali adulte per ingegnerizzare una vagina . Però le cellule staminali presentano importanti problemi : si ries cono ad isolare in numero molto ridotto, presentano un basso potenziale di differenziazione e durante la loro vita sono state esposte a virus e ad agenti tossici , quindi, se prendiamo una cellula staminal e da un bambino e una cellula staminale da un anzian o queste due cellule non funzionano allo stesso modo poiché tutte le cellule del corpo invecchiano e quindi tendono ad essere meno replicative e avere quindi un minor potenziale di differenziazione . 5 Nel 2006 lo scienziato giapponese Yamanaka ha scoperto la possibilità di realizzare cellule staminali pluripotenti indotte (iPS). Questa tecnica consiste nell’isolare cellule da un paziente , ad esempio fibroblasti dalla pelle , e mediante fattori chimici trasform arle in cellule pluripotenti che in seguito possono essere fatte ridifferenziare e utilizza te pe r ingegnerizzare un tessuto o per condurre studi . Si è pensato anche alla possibilità di estrarre cellule da un paziente affetto da problematiche genetiche che causano ad esempio la fibrosi cistica, correggerl e e utilizzarle per ingegnerizzare ad esempio una parte di polmone. In questo caso potremmo utilizzare due tipologie diverse di bioreattori: un bioreattore che consente di svolgere la correzione genetica oppure un bioreattore che consente l’ingegnerizzazio ne del polmone e a seguire la sua correzione. Quindi, nel caso in cui si volessero utilizzare iPS in un bioreattore si deve tener conto del fatto che presentano una tendenza a de -differenziare. Il grafico qui riportato mostra il destino delle cellule staminali : p ensiamo a una montagna sud divisa in più valli, una volta che una cellula percorre un a strada tenderà sempre più a scendere e infilarsi in una o più valli. Quello che si cerca di fare in r icerca al fine di creare alternative differenti per realizzare poi costrutti ingegnerizzati è ad esempio far risalire alle cellule queste valli in modo da riportarle a d uno stadio di pluripotenza e in seguito utilizzarle all’interno di un bioreattore per f arle differenziare in uno specifico tessuto. Ovviamente più si sale a monte più la cellula è pluripotent e e maggiori sono i rischi legati al la tumorigenicità . Oggi quello che si cerca di f are è portare la cellula verso la pluripotenza ma senza raggiunge lo stadio completo, cioè le cellule adulte e differenziate vengono riportate a uno stadio di multipotenza per cui vengono ridotti i rischi oppure in alternativa un’altra possibilità è trattare dir ettamente le cellule differenziate con fattori che consentono loro di differenziare in altri tipi cellular i. Le tipologie di cellule messe all’interno de l bioreattore dettano le specifiche di progettazione del bioreattore stesso. Ad esempio p ensiamo ad u n cuore , se ingegnerizz iamo cellule in uno stato pluripotente vuol dire che tali cellule probabilmente pensano di essere ancora nel tubo inizial e per cui gli stimoli che vanno dati vanno pensati in quella direzione oppure se ingegnerizziamo cellule adulte queste probabilmente p ensano di essere già in un cuore formato per cui si tratta di un altro tipo di approccio. Vediamo ora tutte le caratteristiche da considerare durante la progettazione di un bioreattore, in primo luogo ci chiediamo “ In che modo le ce llule influenzano il design del bioreattore?”. In merito a questa domanda, le caratteristiche da considerare sono le seguenti: • Spesso le cellule staminali sono delicate mentre le cellule adulte sono molto più robuste (esistono poi casi eccezionali) • Ci do bbiamo chiedere se le cellule devono essere differenziate o meno e quindi se in una prima fase facciamo espandere le iPS ch e in seguito vengono fatte differenziare oppure se utilizzare già direttamente cellule specializzate che vengono fatte espandere • Ci dobbiamo chiedere se sono presenti v ariazioni di coltura nel tempo e quindi se c’è la necessità di poter variare quello che succede nel bioreattore nel tempo , inoltre ci dobbiamo chiedere se il tipo di stimoli varia nel tempo • Ci dobbiamo chiedere se utili zziamo solo un tipo cellulare o ppure più tipologie cellulari , se le cellule interagiscono tra loro o meno 6 Teniamo presente che l’ingegnerizzazione dei tessuti non sempre vuole arrivare alla fine a d un costrutto che sia completamente formato e uguale a q uello dell’individuo adulto perché spesso il miglior bioreattore del mondo è il corpo umano stesso, infatti, in alcuni casi l’ingegneria tissutale prevede l’utilizzo de l corpo stesso come bioreattore. In questi casi, visto che sfruttando il bioreattore non è possibile replicare al 100% il tessuto in vivo, si crea un pezzo di tessuto o di organo ingegnerizzato che arriva ad un livello di funzionalità e di attività biologi ca buono ma non completa come in vivo in modo tale da impiantarlo nel corpo e sfruttare il corpo stesso come bioreattore. Ad esempio, se volessimo ricostruire un pezzo di femore per un giocatore di Rugby , possiamo pensare di impiantargli un pezzo di osso ingegnerizzato che consente lui d i camminare e in seguito a un periodo di 3-4 mesi , nel momento in cui questo graft si è rigenera to completamente fino a diventare un osso finito , il giocatore può riprendere a correre. Quindi, non sempre con il bioreattore vogliamo arrivare alla fine del processo di rigenerazione perché la natura ovviament e è molto pi ù brav a del bioreattore a rigenerare i tessuti. Quindi, quando progettiamo un bioreattore dobbiamo sempre sapere l’end -point. Inoltre, la funzionalità di qualsiasi parte del corpo non è data solo dalle cellule ma anche da tutti i tessuti di so stegno che circondano le cellule e che nel corpo sono differenti e specifici in base al distretto corporeo. Ad esempio, l a matrice extracellulare dell’osso è completamente divers a dalla matrice extracellulare della pelle e questo perché sono due tessuti con funzioni molto diverse. Quindi, anche la matrice extracellulare e quindi lo scaffold influenza notevolmente il design del bioreattore. Teniamo conto che la matrice extracellulare non ha semplicemente una funzione passiva di supporto ma è vivente e costituita da una serie di proteine e fattori di crescita che influenzano e stimolano le cellule circostanti. Inoltre, teniamo anche presente che in ogni tessuto del corpo umano sono presenti tantissime tipologie di cellule viventi, ad esempio nel cuore non sono presenti soltanto ce llule endoteliali e cellule muscolari ma anche una serie di cellu le diverse che contribuiscono a formare il tessuto. Inoltre, i l rapporto tra le cellule e la matrice extracellulare varia tra i diversi tessuti del corpo , ad esempio la cartilagine è costituita principalmente da matrice extracellulare mentre la pelle è composta da una componente cellulare preponderante che poggia su una membrana basale. Questo co ncetto è molto importante perché quando progettiamo un bioreattore dobbiamo sapere se le cellule stanno bene anche da sole , come nel caso della cartilagine , oppure necessitano di cellule in vicinanza. E’ importante tenere presente che spesso le patologie non colpiscono solo le cellule ma spesso le patologie alterano la composizione o le proprietà meccaniche della matrice. Ad esempio la fibrosi è una delle possibili cause dei tumori e provoca proprietà meccaniche alterate, cambiamento delle proteine nella matrice extracellulare. Tutte queste informazioni ci possono interessare se progettia mo un bioreattore per generare un tessuto o un organo che poi va impiantato ma anche per realizzare dei mod elli in vitro utili ad esempio per lo studio di terapie personalizzate. Ad esempio, esiste la possibilità di prelevare da una biopsia del paziente cellule da un organo affetto da tumore o da una patologia, ricreare poi in vitro N organi patologici e testar e diversi farmaci per valutare quale funziona meglio sul paziente anziché trattare a priori il paziente con diversi farmaci. Basti pensare che nel 50% dei casi le terapie tumorali non funzionano perché il farmaco è inefficace in quanto da diversi studi è e merso che ogni paziente reagisce in modo diverso ai farmaci. Abbiamo quindi capito che il ruolo dello scaffold non è soltanto quello di fornire supporto alle cellule ma è anche in grado di sostituire temporaneamente la matrice e xtracellulare, infatti, si ccome i tessuti sono composti da cellule e matrice all’interno del bioreattore vengono inserite le cellule che devono essere in grado di produrre la matrice extracellulare corretta e specifica per quel tipo di tessuto. Inoltre, lo scaffold guida le cellu le da un punto di vista di forma e geometria, è evidente che se d obbiamo creare un vaso sanguigno lo scaffold avrà struttura tubo lare. La geometria è importante anche a livello di micro struttura e macr ostruttura in quanto lo scaffold che permette di guidar e le cellule nel bioreattore , ad esempio se si vuole creare un muscolo bisogna fare in modo che le cellule si allunghino e creino fibrille muscolar i e poi è importante che lo sforzo che viene dato nel bioreattore tenga conto di c ome sono fatte tali fibre e quindi direzionare lo stress in un determinato modo. 7 Inoltre, possono essere presenti anche stimoli biochimici nel senso che lo scaffold può essere funzionalizzato con molecole in grado di indirizzare le cellule. I nfine , la biomeccanica e quindi le propr ietà meccaniche promuovono la rigenerazione del tessuto che come detto prima spesso non sono le stesse di un tessuto adulto definitivo ma devono però sostenere la funzionalità e lo stimolo nel bioreattore. Ad esempio, se si deve progettare un bioreattore p er uno scaffold che ha un punto di rottura di 300 N vuol dire che tale del bioreattore deve lavorare in un range di sicurezza rispetto al punto di rottura dello scaffold ed è altrettanto importante scegliere uno scaffold che sia in grado di ingegnerizzare uno specifico tessuto. Consideriamo che spesso le cellule staminali riconoscono l’ambiente circostante e si differenziano in un particolare tipo di cellula senza alcuno stimolo esterno , ad esempio se una cellula staminale viene posizionata su uno scaffold avente bassa rigidezza probabilmente può differenziarsi in un neurone e viceversa se viene posizionata su uno scaffold molto duro può probabilmente differenziarsi in un osteocita. Anch e l’ambiente è importante, ad esempio se una cellula staminale è a contatto con un liquido che scorre probabilmente può differenziarsi in una cellula endoteliale. Esistono d ivers e tip ologie di scaffold che possono essere utilizzate nei bioreattori: s caf fold di tipo naturale derivati da tessuti decellularizzati, da tessuti crio -preservati, irradiati, idrogeli, oppure da tessuti trattati chimicamente . Scaffold sintetici come scaffold in Dacron, PCL o idrogeli sintetici oppure scaffold ibridi che sono la co mbinazione d i scaffold naturali e scaffold sintetici . Ovviamente la tipologia di scaffold utilizzata determina una serie di scelte dal punto di vista della chimica e della degradazione dello scaffold . A d esempio se facciamo un bioreattore progettato alla perfezione con un circuito di perfusione millimetrico ma inseriamo uno scaffold che si degrada e nel tempo rilascia piccole particelle che otturano il tubo, ovviamente il bioreattore non funziona più . Capiamo quindi che per risolvere questa problema possi amo ad esempio utilizzare un filtro oppure lo scaffold utilizzato era troppo poroso e quindi alcune bolle rimangono catturare all’interno e nel tempo si muovono e si accumulano nel circuito. Ci chiediamo quindi “ In che modo l o scaffold influenza il design del bioreattore?” : • Lo scaffold influenza il bioreattore in termini di f orma e dimensioni del tessuto, quindi, ci dobbiamo chiedere se stiamo realizzando un tessuto di piccole o grandi dimensioni e se è un tessuto umano o un tessuto murino . Vedremo che i ngegnerizza re un lobo polmonare umano è molto diverso da ingegnerizzare un polmone di topo soprattutto in termini di forma, dimensioni e complessità infatti è molto diverso progettare un bioreattore che deve alimentare un tubo o due polmoni attaccati con l a trachea • Ci dobbiamo chiedere in che modo teniamo il tessuto che si sta formano all’interno del bioreattore e quindi se Il tessuto è clampato, intubato oppure se viene fatto galleggiare • Ci dobbiamo chiedere se quanto forte possiamo tenere il tessuto e q uali stimoli lo scaffold può sostenere • Infine, è importante considerare la macro struttura e la microstruttura , ci dobbiamo chiedere se lo scaffold è poroso e quali proprietà meccaniche presenta, ad esempio se ha una notevole risposta elastica Quindi, abbiamo capito che il bioreattore ha il compito di dirigere l’interazione tra le cellule e lo scaffold al fine di ottenere un buon tessuto ingegnerizzato . 8 Il bioreattore svolge i seguenti ruoli: • Fornisce e/o controlla un ambiente controllat o, infatti durante una reazione biologica è importante controllare la temperatura affinchè sia mantenuta a 37 °C (temperatura corporea) , la concentrazione di, la concentrazione di anidride carbonica che è il prodotto di scarto della reazione cellulare, il pH in quanto le cellule del corpo umano lavorano a livelli di pH molto ristretti e una variazione anche di solo 1/10 di pH nel corpo comp orta gravi problematiche , e infine deve controllare la pressione avvertita dal le cellule, l’apporto di nutrienti e la rimozione di cataboliti . Teniamo conto che le uniche cellule del corpo che avvertono una concentrazione di ossigeno pari al 20% sono le ce llule dell’epitelio degli alveoli dove avviene lo scambio di ossigeno nei polmoni mentre in tutto il resto del corpo le cellule sentono una concentrazione di ossigeno molto bassa • Fornire e/o controllare uno stimolo. Lo stimolo può essere : biologico , c himi co o fisico come ad esempio uno stimolo fluidodinamico, meccanico, elettrico. Non è detto che il bioreattore sia lui stesso a fornire lo stimolo e il controllo, a volte è presente un dispositivo esterno di controllo del bioreattore oppure altre volte all’i nterno del bioreattore vengono aggiunti dall’esterno molecole e fattori chimici oppure il bioreattore può presentare un motore che fornisce lo stimolo fisic o • Deve garantire la sterilità , il bioreattore internamente deve essere sterile e tutto ciò che entr a a contatto con le cellule e con lo scaffold deve essere sterile . Spesso il mantenimento della sterilità è uno deg li aspetti più difficili da garantire, vedremo come a volte nel le soluzioni costruttive progettuali molte difficoltà si incontrano nel mante nere la sterilità Tipicamente un bioreattore è composto da una camera dove sono presenti le cellule, lo scaffold e il terreno di coltura , da tubi esterni e un sistema di attuazione che consente di fornire lo stimolo e far funzionare il bioreattore, un sistema di controllo, un eventuale sistema di feedback e una interfaccia utente. La camera è il cuore del bioreattore dove è collocato il tessuto o l’organo che viene rigenerato e spesso è la parte più difficile da progettare. La camera d eve essere sterile, avere dimensioni adeguate al tipo di tessuto , deve avere un supporto in grado di tenere e afferrare il tessuto, dev e essere dotato di accessi per poter collocare all’interno il tessuto ma simultaneamente far questo è complicato perché bisogna mantenere la sterilità. Inoltre, deve a vere sistemi idraulici, accessi ottici che permettono di osservare cosa acca de all’intern o del bioreattore , infine deve essere biocompatibile . In figura è mostrata un esempio di camera di un bioreattore per l’ingegnerizzazione dell’intestino . L’intestino collocato all’interno della camera è stato cannulato in tre punti vascolari . In questo e sempio la camera è stata dimensionata sulle dimension i dell’ intestino di ratto ma bisogna tenere a mente che nella camera devono poter essere contenute anche le tre cannule . 9 È una camera sterile in quanto presenta una guarnizione , è caratterizzata inoltr e da una porta di ventilazione su cui è stato posizionato un filtro avente pori di 0.22 micron che fa sì che l’aria che entra sia sterile e priva di batteri. Il tessuto viene sostenuto dalle cannule stesse e i tubi permettono a l terreno di coltura contenut o all’interno di essere ricambiato . Infine, la camera è trasparente e realizzata in Teflon, un materiale considerato biocompatibile. L’ambiente di coltura deve c ontrollare la temperatura , pu ò controll are la concentrazione di anidride carbonica (spesso la C02 determina una variazione del pH), il pH o la concentrazione di ossigeno, non è detto che la coltura che dobbiamo fare venga fatta al 20% di ossigeno, ad esempio le iPS sono cellule che vengono colt ivate al 4% di ossigeno. L’ambiente di coltura ò essere parte o meno di un bioreattore, infine, spesso i bioreattori vengono collocati all’interno di incubatori di coltura cellulare che consentono di mantenere i valori di temperatura, concentrazione di oss igeno e anidride carbonica controllati. Quindi, è possibile realizzare un bioreattore che non sia in grado di controllare lui stesso tali parametri ma che viene inserito all’interno di un ambiente controllato . Il sistema di attuazione fornisce la dinamici tà alla coltura ovvero fornisce uno stimolo che varia nel tempo ed è quello che caratterizza le colture nei bioreattori che sono tendenzialmente dinamiche . Il sistema di attuazione serve a fornire uno o più stimoli, ovviamente a seconda d ello stadio di mat urazione del tessuto varia il tipo di stimolo che viene fornito perciò è importante dimensionare il sistema di attuazione in modo tale da fornire la stimolazione che mi interessa. L’interfaccia utente può essere un pulsante o una app licazione sul telefon o che controlla il bioreattore, quindi, è qualsiasi cosa che permette il contatto tra l’utente e il bioreattore e non riguarda solo la component e elettronica ma anche la maneggiabilità, la facilità di inserire il tessuto all’interno della camera. Inoltre , durante la progettazione va considerato che spesso l’utente finale non è colui che ha progettato il bioreattore ma può essere un altro ingegnere , un medico o ppure un biologo e quindi q uando si proget ta un dispositivo bisogna pensare all’utilizzatore finale . Vediamo alcuni esempi di possibili stimoli : Nel caso del muscolo scheletrico è presente uno stimolo a trazione uniassiale mentre nel caso dell’intestino cannulato si ha u no stimolo di perfusione , cioè viene fatto circolare del liquido. Nel caso del vaso sanguigno è presente uno stimolo di perfusione ma anche un sistema RC idraulico che consente il rigonfiamento ciclico del vaso e stimola le cellule muscolari. Ad esempio, se volessimo ingegnerizz are un muscolo cardiaco poss iam o avere una membrana che viene stimolata bi -assialmente e poss iamo realizzare d ei modelli computazion ali che permett ono di predire gli stress presenti. 10 Ogni bioreattore deve possedere un sistema di controllo che consente il f unzionamento di tutte le diverse parti elettriche che a loro volta fanno funzionare il sistema di attuazione (vedremo come si progetta un sistema di controllo di un bioreattore) . Invece, il sistema di feedback non è sempre presente e permette al sistema di controllo di pilotare il sistema di attuazione. Il sistema di feedback può essere più o meno preciso a seconda delle cellule presenti all’interno del bioreattore, ad esempio se stiamo lavorando con cellule staminali molto delicate è importante che il pH venga monitorato continuamente perché altrimenti anche una piccola variazione può portare al loro differenziamento. Quindi, è necessario in questo caso prevedere un sensore di pH che monitora continuamente i l pH e dice al sistema di controllo se aggiungere sistema di coltura fresco nella camera. Invece, se stiamo lavorando con c ellul e adult e non è necessario il sensore di pH perché anche perché per una lieve variazione non differenziano, quindi, in questo c aso può essere sufficiente cambiare il terreno di coltura ogni tot giorni per garantire la vitalità e la funzionalità delle cellulare. In maniera analoga, se le cellule utilizzare nel bioreattore sono sensibili alle variazioni di temperatura sarà fondame ntale prevedere un sensore di temperatura. Teniamo presente che quando progettiamo è importante essere il più semplici possibili nella realizzazione perché p iù il design è semplice e m inore è il rischio di rottura e il costo. Esempio pratico: immaginia mo di voler ingegnerizzare un vaso sanguigno Quali funzioni dobbiamo prevedere del tessuto che vogliamo ingegnerizzare? Per esempio un vaso sanguigno è un tubo che deve rimanere pervio, non deve far coagulare il sangue , svolge funzione di barriera selettiva in quanto la parete del vaso permette il passaggio di a lcune proteine, molecole e cellule del sistema immunitaria in presenza di una infiammazione, inoltre è in grado di regola re le dimensioni del lume . È caratterizzato una r iposta elastica , ad esempio l’aorta ascendente fino all’addome ha una risposta elastica all’onda pulsatile del cuore per cui non è semplicemente un tubo rigido dove passa il sangue ma l’aorta si deforma, assorbe energia elastica che poi rilascia. Infine, c ontiene una serie di segnali biochimici che fornisce alle cellule vicine . Sulla base de lle funzioni desiderate è necessario decidere come progettare il bioreattore perché se d obbiamo semplicemente far sì che sia un tubo che resti pervio può essere suffici ente la perfusione ma se vogliamo istruire le cellule endoteliali a svolgere la funzione di barriera selettiva è necessario progettare il bioreattore affinchè fornisca uno stimolo alle cellule endoteliali per aprirsi e consentire il passaggio di alcune cel lule . Quindi , a seconda delle funzioni che vogli amo ingegnerizzare le specifiche progettuali cambiano notevolmente. 11 Quali cellule inseri amo nel bioreattore? In un vaso sanguigno sono presenti cellule endoteliali nel lume, cellule muscolari sulla parete e a seconda della dimensione del vaso (arteria o vena) si ha una diversa numerosità di c ellule muscolari , ci sono poi a ltre cellule di supporto come i fibroblasti e i periciti . I periciti sono cellule che abbracciano i capillari e li stabilizzano da un punt o di vista biochimico. E’ chiaro dunque che a seconda delle cellule che inseriamo nel bioreattore dobbiamo prevedere un terreno di coltura che vada bene per tutti i tipi cellulari. Ad esempio, se i periciti sono posti a l di fuori del vaso si deve progett are un vaso al cui interno è presente un circuito indipendente in cui scorre il primo terreno di coltura e all’esterno del vaso un altro terreno di coltura specifico per i periciti. Una volta scelte le tipologie di cellule da ingegnerizzare, a quale stadio prendiamo tali cellule? È molto diverso ingegnerizzare delle cellule adulte o delle iPS perché nel caso di cellule iPS è importante controllare in maniera fine la temperatura e il pH tramite dei sensori mentre nel caso di cellule adulte non sono necessari tali sensori. Quali condizioni di coltura sono richieste ? Un solo terreno di coltura o più terreni di coltura? Le condizioni rimangono invariate dall’inizio alla fine della coltura? Probabilmente all’inizio della coltura vogli am o sol amente far espandere le cellule iPS e quindi necessitiamo di un unico terreno di coltura sia per l’interno che per l’esterno del vaso ma a un certo punto si deve avere la possibilità di cambiarlo allora bisogna costruire un bioreattore dotato di un sistema che consenta di fare ciò , quindi , sulla base del quesito biologico si creano i quesiti tecnologici che definiscono le specifiche di progetto. Che stimolo vogli amo applicare ? Se v ogliamo applicare la s olo perfusione è semplice ma magari vogliamo applicare anche un o stretching circonferenziale che probabilmente induce i periciti a differenzia re in cellule muscolari al fine di regolare l’apertura e la chiusura dei capillari allora in questo caso dobbiamo pensare a d una pompa pulsatile e ad un sistema che presenta una resistenza idraulica per cui il vaso si gonfia e si sgonfia . Questo stimolo è lo stesso dall’inizio alla fine della coltura? Bisogna definire questa specifica, m agari dobbiamo poter variare la resistenza idraulica al termine del processo in modo tale che all’inizio il vaso si gonfi e si sgonfi di poco ma alla fine si gonfi e si sgonfi di tanto . Qual è la dimensione del costrutto che stiamo ingegnerizzando? Quante cellule vengono inserite nel bioreattore? A seconda delle dimensioni del tessuto cambiamo molto le specifiche del bioreattore, ad esempio ingegnerizzare una vena safena o un piccolo cap illare è molto differente nonostante sia sempre un vaso sanguigno. 12 È un bioreattore per produzione di massa o per utilizzo singolo? Progettare un bioreattore in grado di ingegnerizzare diversi vasi contemporaneamente e in un ambiente industriale è molto diverso dal progettare un bioreattore per un singolo vaso di piccole dimensioni per un laboratorio di ricerca. Che tipo logia di scaf fold viene utilizzato ? A seconda della tipologia di scaffold (poroso, sintetico, biologico ) cambia notevolmente la progettazione del bioreattore, ad esempio se volessimo avere nel bioreattore due terreni di coltura che stiano separati lo scaffold d ovrà essere impermeabile. Quali parametri d obbiamo/ vogli am o controllare e in che modo ? Possiamo sfruttare diverse tipologie di s ensori (invasivi o ottici ), ad esempio se do bbiamo controllare il pH poss iam o u tilizza re una sonda ma se questa viene inserita al l’interno del bioreattore deve essere anche sterile. Pos siam o sfrutt are sensori ottici ovvero sensori che cambiano di colore al variare del pH ma che sono meno precisi della sonda . In questo corso acquisiremo una serie di conoscenze e competenze che ci permetteranno di progettare ed eventualmente realizzare un bioreattore per l’ingegneria dei tessuti. L’aspetto importante da considerare sempre è che tutte le caratteristiche delle c ellule e degli scaffold che vengono utilizzati all’interno del bioreattore contribuiscono a definire le specifiche progettuali del bioreattore , quindi, ogni elemento che viene inserito o che compone il bioreattore ha influenza sul bioreattore stesso.